资源描述：
《分支杆菌鉴定方法的比较研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、分支杆菌鉴定方法的比较研究 材料与方法：试验菌株：(1)标准菌株：结核分支杆菌H37RV、牛分支杆菌、鸟分支杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、瘰疬分支杆菌、偶然分支杆菌和耻垢分支杆菌标准株，均购自北京结核病胸部肿瘤研究所。(2)临床分离株：来自我院结核病住院患者的痰、胸液和脑脊液。 传统分型鉴定试验：(1)培养鉴定试验：按常规制备对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基，取试验菌株菌悬液(10-2/ml)0.1ml接种，37℃培养，4周看结果。(2)生化试验：68℃耐热过氧化氢酶试验、硝酸还原试验和吐温80水解试验，均按常规操作。 微菌落观察法：取试验菌株在37℃培
2、养2～3周的斜面生长物，用无菌生理盐水配制相当于10-3mg湿菌/ml接种液，取0.1ml接种匡氏琼脂平皿3个，涂匀后置36℃含5%CO2的温箱培养3、7、12d后分别在100倍显微镜下观察微菌形态，记录结果。 多重PCR鉴定法：多重PCR的三对引物是：MT1和MT2、PT1和PT2、IS5和IS6，它们分别扩增表达32000蛋白的基因序列［1］、MTP40蛋白的基因序列［2］和IS6110插入序列［3］。DNA扩增采用的PCR仪为英国Techne公司产品，型号为GeneE，操作见参考文献［4］。 结果与讨论 三种菌种鉴定法用于分支杆菌鉴定所耗时间见表1。表1 三种方法用于200株分支
3、杆菌鉴别耗用时间比较鉴别方法鉴别内容平均耗时(d)传统法结核、牛分支杆菌与非结核分支杆菌28微菌落观察法结核菌群与非结核分支杆菌7.8多重PCR法结核、牛分支杆菌与非结核分支杆菌2～3表2 三种方法用于分支杆菌菌型鉴别的结果比较方 法 受试菌株数正确鉴别菌株数%传统法20019396.5微菌落观察法20019497.0多重PCR法20019698.0 注：经χ2检验，三种方法鉴别正确率比较P＞0.05 三种方法用于200株分支杆菌鉴定结果见表2。200株受试菌株中，有非结核分支杆菌11株，牛分支杆菌2株，其余187株均为结核分支杆菌，其中非结核分支杆菌株占5.5%。采用传统鉴定法，
4、有4株结核分支杆菌株和2株非结核分支杆菌菌株鉴别不明确。微菌落法鉴别错误的有4株，其中2株由于平皿上有杂菌污染而错误地鉴定为非结核分支杆菌菌株。故在操作过程中严防杂菌污染，对提高微菌落法鉴定分支杆菌的准确率具有重要意义。多重PCR扩增分支杆菌DNA时产生1～3条带，其中引物MT1-MT2扩增一条500bp的分支杆菌属特异DNA片段；引物IS5-IS6扩增一条1000bp长的结核分支杆菌菌群特异DNA带；引物PT1-PT2扩增一条约400bp的结核分支杆菌种特异片段。扩增产物电泳后，结核分支杆菌DNA标本产生3条带，牛分支杆菌DNA标本产生2条带，非结核分支杆菌DNA标本产生1条带。影响多重
5、PCR鉴定分支杆菌效果的主要因素是复性温度和Taq酶质量。多重PCR法复性温度为71℃，与延伸温度只差1℃，必须很准确。表1结果表明，采用传统法鉴定分支杆菌需28d，与微菌落法和多重PCR法相比差异有非常显著性(P＜0.001)；微菌落法需7.8d，与多重PCR法相比差异有显著性(P＜0.01)。三种方法相比，多重PCR法用于分支杆菌菌种鉴定所耗时间最短，其次是微菌落法，传统法耗时最长。表2结果表明，三种方法用于分支杆菌菌种鉴定的正确率差异无显著性(P＞0.05)。本研究提示，微菌落法和多重PCR法对分支杆菌菌种鉴定具有快速、准确的优点，较传统法更能满足结核病临床的需要。参考文献 1.B
6、orremansM,deycobacteriumtuberculosis.InfectImmun,1989,57：3123-3130. 2.ParraCA,LondonoLP,DelPortilloP,etal.Characterizationandmolecularcloningofaspecies-specificsequence.InfectImmun,1991,59:3411-3417. 3.ThierryD,Brisson-NoelA,Vincent-Levy-FrebaultV,etal.CharacteristicofaMycobacteriumtuberculosisi
7、nsertionsequence,IS6110,anditsapplicationindiagnosis.JClinMicrobiol,1990,28:2668-2673. 4.DelPatriciaP,ThomasMC,MartineE,etal.MultiprimerPCRsystemfordifferentialidentificationofMycobacteriainclinicalsamples.JClin
