分枝杆菌计数方法的比较研究

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1、分枝杆菌计数方法的比较研究作者：罗泰来，申亮亮，柏银兰，薛莹【关键词】紫外分光光度计法；湿重法；平板菌落计数法；标准曲线；牡牛分枝杆菌　　parativestudyofMycobacteriumcountingmethods.L.编辑。　【Abstract】AIM:TobuildupafastcountingmethodforMycobacteriumvaccae(M.vaccae).METHODS:.vaccaebyUVspectrophotometry,easurementandplatecountmethod,andbuiltuptetrytoplatecountandtheotheri

2、detryandallinearcorrelationbet105/mLto108/mL.CONCLUSION:Themethodisdependable,andcanbeusedforquickcountingofM.vaccae.　　【Keyetry;easurement;platecount;standardcurve;Mycobacteriumvaccae　　【摘要】目的：建立牡牛分枝杆菌的快速检测方法.方法：采用紫外分光光度计法、测湿重法、平板菌落计数法测定细菌数，建立紫外分光光度计法、测湿重法对平板菌落计数法的标准曲线.结果：建立了紫外分光光度计法和湿重法相对于平板计数法的标准曲线

3、，通过准确度分析表明在细菌含量在每毫升105～108之间时，两标准曲线线性关系良好.结论：该方法可用于牡牛分枝杆菌的快速计数.　　【关键词】紫外分光光度计法；湿重法；平板菌落计数法；标准曲线；牡牛分枝杆菌　　0引言　　结核病目前仍是严重危及全球的公共卫生问题之一.据世界卫生组织估计［1］，当前全球约有20亿人受结核分枝杆菌感染，我国近5亿人感染.因此，结核病的研究已成为传染病研究的热点之一.在科研工作中，如进行转化、毒株攻击等时，需要即时检测细菌的浓度范围.但分支杆菌的生长较慢，用普通的平板计数法进行计数，不能满足时效性.因此，找到一种快速计数分支杆菌的方法，将为科研提供极大便利.牡牛分支杆菌

4、是一种快速生长型分支杆菌，广泛应用于结核病的发病机理和疫苗研究中.本文研究紫外分光光度法、测湿重法和平板计数法间的关系，绘制紫外分光光度计法和测湿重法标准曲线，建立能快速计数的方法.　　1材料和方法　　1.1材料紫外分光光度仪（JENeter）、电子天平，离心机（eppendorfcentrifuge5415D）,牡牛分枝杆菌（由微生物教研室保存）；LB培养基，每200mL含NaCl2g、营养粉2g、酵母提取物2g，固体培养基加入琼脂粉3.5g；7H9培养基（DIFCO）.　　1.2方法　　1.2.1紫外分光光度计法测吸光度用接种环在从分枝杆菌菌种中取一环菌，接种到5mLLB培养基中.置于37

5、℃摇床中振荡培养约24h，使细菌活化.测吸光度值，当吸光度值＞0.6时将细菌按1∶100的比例转接到200mLLB培养基中扩大培养，置于37℃摇床中振荡培养.每隔3h在超净工作台中用无菌移液枪从培养基中吸取5mL菌液，于无菌短中管中，其余菌液放入摇床中继续培养.用1mL一次性注射器将短中管中菌液反复吹打，充分重悬，使聚集生长的细菌充分混匀.取6个5mL离心管，每管加入去离子水2mL分别标记1～6待用.从混匀后的菌液中取1mL，用离心机离心，11000g,1min，收集菌体沉淀.去上清，再次离心，充分除去培养液.用2mL去离子水重悬，以去除LB培养基对吸光度值的影响.按倍比稀释法，将菌液进行稀释

6、，得到6个稀释度.细菌稀释倍数依次为2-1到2-6.用去离子水做对照，依次对10个离心管中的菌液测吸光度值.　　1.2.2用电子天平称细菌湿重按上述方法将细菌扩大培养.1mL一次性注射器将菌液反复吹打，充分重悬，使成团生长的细菌充分混匀.取12支离心管，分别编号1～12，于电子天平上精确称重，准确记录各管重量.将离心管分成3组，分别为1～4号、5～8号、9～12号.第1组每管称量菌液0.5mL，第2组吸1.0mL，第3组吸1.5mL.离心，11000g，1min.去上清，吸干培养基，再次离心，直到较好的去除培养基.将收集了细菌的离心管于电子天平上准确称重，记录重量.用第二次重量减去第一次重量所

7、得差值即为湿重.将各湿重除以各管所吸取菌液体积，即得每毫升菌液的细菌湿重，取平均值，即为每毫升菌液所含细菌湿重.　　1.2.3平板菌落计数法测活菌浓度按上述方法将细菌扩大培养.每隔3h在超净工作台中用无菌移液枪从培养基中吸取5mL菌液，于无菌短中管中，其余菌液放入摇床中继续培养.用1mL一次性注射器将短中管中菌液反复吹打，充分重悬，使成团生长的细菌充分混匀.按十倍递增稀释至10-3~10-7.取1