小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究

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1、小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究作者：常娟娟，江一平，王明权【摘要】目的对性成熟前小鼠的窦前卵泡采用不同的方法进行玻璃化冷冻，探讨不同冷冻方法对卵泡复苏率的影响。方法用Ⅰ型胶原酶和脱氧核糖核酸酶Ⅰ分离10～14dICR雌鼠的卵巢，共进行A、B两个实验，每次实验对获得的卵泡分为4组，1组作为新鲜对照组，其余3组采用不同的冷冻方法处理,试验A采用常规玻璃化法、－205℃玻璃化法和液氮网篮法；试验B采用－205℃玻璃化法、液氮网篮法和－205℃表面玻璃化法，卵泡复苏后进行台盼蓝染色，计算各组卵泡复苏率。结果液氮网篮和－205℃玻璃化冷

2、冻的冷冻效果一致，两种方法的卵泡复苏率差别无统计学意义；常规玻璃化的冷冻效果最差，－205℃表面玻璃化冷冻的冷冻效果最好，其冷冻小鼠窦前卵泡的复苏率达(83.02±4.10)%。结论－205℃表面玻璃化是一种较好的冷冻窦前卵泡的方法。【关键词】卵泡；卵子；冷冻；组织保存；小鼠，近交ICRABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofdifferentmethodsontherecoveryrateofpreantralfollicleofimmaturemiceaftertheyale

3、mice(10～14dofage).Tents(AandB)ethods.InExperimentA,conventionalvitrification,－205℃vitrificationandmetalentB,－205℃vitrification,metaland－205℃surfacevitrificationadopted.Afterrecovery,folliclesents，theeffectofmetaland－205℃vitrificationareconsistent.There.Theeffectofcon

4、ventionalvitrification;freezing;tissuepreservation;mice,inbredICR卵巢组织、细胞的冷冻保存技术是生殖工程的重要内容之一，可为体外授精、显微授精和体细胞核移植等需要储备和供应卵源的实验提供技术保障[1]。在既往的研究中，冷冻复苏的卵母细胞和卵巢组织都有部分能够发育到囊胚或者生育幼仔[26]，说明冷冻复苏后的卵母细胞及或各级卵泡保持了正常的发育潜能。但采用常规程序冷冻法和常规玻璃化冷冻法保存的卵巢组织、细胞，复苏率不高且方法繁琐[4]。本研究采用从小鼠卵巢分离的窦前卵

5、泡为材料，探索建立适宜的窦前卵泡快速玻璃化冷冻保存技术，为卵泡保存和生殖工程提供技术基础。　　1材料与方法　　1.1动物来源　　出生10～14d的ICR雌鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司，SCXK（沪）2003003]。　　1.2仪器及试剂　　Vitmaster玻璃化快速冷冻仪（URVD000036，英国IMTLtd）；ɑMEM(32571，美国Gibco公司)；牛血清白蛋白（BSA，A3311，美国Sigma公司）；Ⅰ型胶原酶（collagenaseⅠ，265，美国Gibco公司）；1mg/mL脱氧核糖核酸酶（DNase

6、Ⅰ，10104159001，瑞士Roche公司）；HEPES（H6147，美国Sigma公司）；乙二醇（EG，E9129，美国Sigma公司）；海藻糖[D（＋）Trehalosedihydrate，T0167，美国Sigma公司]；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，0507，美国Amresco公司）；台盼蓝干粉（Trypan，T6146，美国Sigma公司）；含卵泡分离液的双腔培养皿（353037，美国Falcon公司）；清洗皿：含体外操作液的35mm培养平皿（353001，美国Falcon公司）。　　1.3方法　　1.3.1溶液配制

7、　　基础液：采用添加4mg/mL牛血清白蛋白的αMEM作为卵泡分离液、体外操作液、玻璃化冷冻液和复苏液的基础液；卵泡分离液：于基础液中添加3mg/mLⅠ型胶原酶、1mg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ；体外操作液：于基础液中添加25mmol/LHEPES；平衡液（equilibrationmedium，EM）[7]：于基础液中添加4%乙二醇；玻璃化冷冻液（solidsurfacevitrification，SSV）[7]：于基础液中添加35%乙二醇0.4mol/L海藻糖、5%聚乙烯吡咯烷酮；复苏液：包括Ⅰ、Ⅱ，分别为基础液中添加0.3m

8、ol/L、0.15mol/L海藻糖；台盼蓝染液（0.4%）：0.4g台盼蓝干粉溶于100mL生理盐水。　　1.3.2分离窦前卵泡　　颈椎脱臼法处死小鼠，消毒腹部皮肤，打开腹腔，找到卵巢，取出双侧卵巢，放入PBS中清洗，转移2～4个卵巢至0.5mL的卵泡分离液中，