载脂蛋白e基因多态性与中国人2型糖尿病肾脏并发症的相关性研究

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1、载脂蛋白E基因多态性与中国人2型糖尿病肾脏并发症的相关性研究作者：张广吾张爱珍许则峰【摘要】目的研究ApoE基因多态性与中国人2型糖尿病及其肾脏并发症（DN）的相关性。方法以ApoE基因为候选基因，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析法检测78例糖尿病患者和49例健康体检者的ApoE基因型，其中合并肾脏并发症40例，无肾脏病变(DRD)38例。结果DN组ApoE的ε2等位基因频率明显高于DRD组和正常对照组(P＜0.05)。DM患者的年龄、病程、高血压、GHB及ApoEε2等位基因频率与DN关系的Logistic回归分析：病程和ApoE的ε2等位基因与DN的

2、发生密切相关（P<0.05），病程对DN的OR值为1.1494，而ApoE的ε2等位基因对DN的OR值为7.6514。结论ApoE的ε2等位基因是2型DM并发DN的遗传易感因子。【关键词】糖尿病载脂蛋白E基因多态性　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatetherelationshipbetorphismandChinesepatientsellitusanddiabeticnephropathy(DN).MethodsApoEgenotypeinedbyPCR-RFLPin78diabetes(38inatedbyLogisticregression

3、,itorphism糖尿病肾病（DiabeticNephropathy，DN）是糖尿病（DiabetesMellitus，DM）最常见的并发症之一，也是DM患者的主要死亡原因之一。其发病机制至今未完全阐明，国外研究表明载脂蛋白E(ApoE)基因多态性可能与DN发生有关［１］。本研究采用聚合酶链反应─限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术分析中国DM人群的ApoE基因分布与DN的相关性。报道如下。　　1资料与方法　　1.1一般资料　　随机选择1998年7月至2000年2月2型DM患者78例为D组，男32例，女46例；年龄36～79岁，平均（61.21±10.09）岁。均符合oge

4、nsen的DN分级标准，将不同时间2次尿白蛋白排泄率（UAER）均>30mg/24h者归入DN，其余归入糖尿病无糖尿病肾病组（diabeteser病及肝病。　　1.2方法　　ApoE基因型检测采用PCR-RFLP法分析。(1)人血白细胞DNA抽提常规苯酚/氯仿法。(2)PCR扩增：引物链参照RichardP等设计的序列［２］：上链:5'-AACAACTGACCCCGGTGGCG3',下链:5'-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC3'。反应体系：总体积50μl,模板DNA1μl,引物上链2μl,引物下链2μl,dNTPs2μl，Taq酶0.5μl，DMSO液5μl,10×b

5、uffer/mg2+5μl，ddH2O32.5μl。反应在扩增仪（PERKINELMERGENAMPPCRSYSTEM9600）上进行：95℃预变性5min，继而95℃变性45s、65℃退火30s、72℃延伸30s共30个循环，最后一步72℃延长10min，冷却至4℃。(3)目的片段检测和提纯：取PCR产物15μl+3μlloadingbuffer行1.5%琼脂糖电泳(已加溴化乙锭)目的片段检测，电泳条件为80V，45min。用2倍体积氯仿提纯PCR产物,去除DMSO等影响酶活性物质。(4)扩增片段的限制性酶切：酶切体系总体积20.2μl：提纯后PCR产物16μl,HhaI酶2μl,

6、10×buffer(B)2μl,BSA0.2μl。置于65℃水浴过夜，次晨取出后置65℃水中10min，终止酶切反应。(5)酶切片段检测：取酶切产物3μl+3μlloadingbuffer,行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为150V,65min,经染色显色,拍照并制膜记录结果。　　1.3临床参数与生化指标　　（1）测量研究对象的血压、身高及体重：计算体重指数（BMI）=体重（kg）/身高2（m2）；（2）糖化血红蛋白（GHB）测定：微柱法；（3）尿微量白蛋白测定：速率散射比浊法；（4）血脂检测：用酶法测定甘油三脂（TG），总胆固醇（TC）及高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-c）。LD

7、L-c测定采用比浊法。　　1.4统计学处理　　采用SPSS统计包。各组间ApoE等位基因频率用计数法获得，各组间ApoE等位基因频率比较用χ2检验；各项指标比较用t或t'检验；分析病程、HDL、高血压和ε2等位基因对DN发生的影响时用Logistic回归分析。　　2结果PCR扩增产物经酶切后，常见有6种基因型，其中ε2等位基因含91，83，60bp条带,ε３含91，60，48，35bp条带，ε4等位基因含72，60，48，35bp条带。DRD、DN组与正常