遗传性对称性色素异常症一个家系dsrad基因突变分析

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1、遗传性对称性色素异常症一个家系DSRAD基因突变分析作者：李敏，王丽君，张彩娥，吴雄文，邓云华【摘要】目的：通过对一遗传性对称性色素异常症家系的致病基因DSRAD进行检测，以期寻找到新的致病突变.方法：采用RTPCR方法从人外周血中获得DSRAD基因cDNA，然后克隆至pTA2vector,经阳性克隆筛选后进行基因序列测定，通过BLAST程序网上比对找出可能突变位点，再采用单链构象多态性技术进行新突变验证.结果：对该家系DSRAD基因测序发现患者存在碱基替换A1167G(Q389Q)，由于编码的氨基酸未改变，均为谷氨酰胺，为一种同义突变.经单链构象多态性分析证明该突变只存

2、在于该家系患者，不存在于家系健康人和100名无亲缘关系对照者.结论：该同义突变可能导致患者皮肤色素异常改变，其具体的机制尚需进一步研究.【关键词】遗传性对称性色素异常症；突变；DSRAD基因；cDNA克隆；聚合酶链反应；多态现象，单链构象0引言遗传性对称性色素异常症(dyschromatosissymmetricalhereditaria,DSH)，1924年首先由Toyama等在日本报道.该病主要发生于日本和中国，另外韩国、印度、欧洲和北美也有少量报道［1］.DSH多为常染色体显性遗传，具有较高的外显率，亦有散发患者和常染色体隐性遗传的报道［2］，其发病机制尚不清楚.近年

3、来，国内外多个研究小组对该症进行了系列遗传学研究，最终确定了其致病基因为双链RNA特异性腺苷脱氨酶(doublestrandedRNAspecificadenosinedeaminase,DSRAD)［3］.到目前为止，在DSH患者中共发现40余种DSRAD基因的突变.为完善该症的突变谱，我们对一个DSH家系的DSRAD基因进行了突变检测，研究DSRAD基因的突变位点在皮肤的色素代谢中可能起到的作用.1对象和方法1.1对象本研究中家系3代，共11人，其中6例患者（图1）.先证者:女,9岁，体格发育和智力与同龄人相仿,未发现明显的系统症状.3岁时出现手背散在色素减退斑，随着年

4、龄增大，色素减退斑越来越明显，并夹杂色素沉着斑点，皮损缓慢蔓延，目前已侵及手腕部及右脚踝，皮损夏季明显而冬季减轻.先证者的母亲(II2)自述3岁左右开始出现皮损，目前色素异常性皮损主要位于手足背，呈对称性分布，面部有少量雀斑样皮损.先证者的舅舅(II1)及其儿子(III2)女儿（III3）有类似表型，于四肢末端陆续出现深浅不一的色素减退斑，间杂褐色斑片,其临床表现符合DSH.所有患者黏膜、指(趾)甲、牙齿和毛发均正常.图1DSH家系图1.2方法1.2.1遗传物质的获取获得知情同意后，无菌采集该家系成员静脉血5mL，常规提取基因组DNA；同时还采集先症者与一名正常家系

5、成员静脉血5mL以提取mRNA.100名对照（以排除可能存在的基因多态性）来自湖北及周边地区的正常人，未发现有色素异常.1.2.2引物设计与合成根据GenBank中公布的人DSRAD基因的cDNA序列通过Primer5.0软件设计3对PCR特异性引物扩增该基因全长，由上海英骏生物技术有限公司合成.引物序列如下：第1对：上游引物P1：5′GGAGTAGCGGAGGCGTGG3′，下游引物P2：5′CTTGCTGGTTCTGGTCTGGC3′；第2对：上游引物P1：5′GTGGAGAATGGGCAGGAA3′，下游引物P2：5′AGCAAGGAGGGCTGGAAG3′；第3对：

6、上游引物P1：5′TCTCACTGGCAGCACCTT3′，下游引物P2：5′CCATCTGTCACTGGAGCAT3′.扩增片段大小分别为1400,1400和1290bp.　　依据比对分析结果，拟对突变部位进行单链构象多态性分析的引物序列为：上游引物P1:5′TTGACAGACAAGAAGCGAG3′，下游引物P2:5′CTGCCCATTCTCCACTTT3′.其扩增产物长度是177bp.1.2.3RTRCR扩增DSRAD基因分离白细胞，用TrizoL一步法抽提基因组mRNA，按照逆转录试剂盒将总的mRNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系

7、包4μL5×buffer(含Mg2+)，2μLdNTP，4μLcDNA，上下游引物各1μL，1.5μLTag酶，加双蒸水至20μL.PCR反应条件为96℃预变性3min,然后96℃变性1min,退火55℃60s,延伸72℃2min,共30个循环，最后72℃延伸10min.PCR产物取5μL以10g/L的琼脂糖电泳，Goldviein，42℃热击90s,再冰浴2min后加入800μL的LB培养液37℃振摇45min，取菌液200μL涂布于含有氨苄青霉素，Xgal和IPTG的LB平板37℃过夜，次日经蓝白筛选,随机挑