his标签单克隆抗体的制备、 鉴定及初步应用

《his标签单克隆抗体的制备、 鉴定及初步应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、His标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用：王文礼,王云龙,李晨阳,陈小科,刘利锋【摘要】　　目的:制备和鉴定抗His标签单克隆抗体（mAb）,初步建立检测和纯化带His标签融合蛋白的方法。方法:用碳化二亚胺法合成His-tag完全抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,通过有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定。结果:His-tag完全抗原偶联成功,经细胞融合、筛选及克隆化,成功获得1株分泌His标签mAb的杂交瘤细胞株。

2、制备腹水测得腹水效价高于1∶106,且此株mAb与其他融合蛋白标签无交叉反应,并在含His标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果。结论:成功制备了1株His标签mAb,为带His标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具。【关键词】His标签单克隆抗体蛋白印迹　　His-tag是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化,His-tag融合标签与其他标签相比有很多明显优势,是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种［1］。利用His标签可以建立一个基于融合蛋白的

3、高效检测和纯化系统。目前商品化His-tag的单克隆抗体(mAb)种类不多,且价格也十分昂贵。因此,研制出His-tag的mAb,在融合蛋白质的研究中具有非常广泛的应用前景。　　1材料和方法　　1.1材料His六肽为西安蓝晶生物科技有限公司合成;卵清白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白（BSA）、兔抗小鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM抗体均购自Sigma公司;HRP标记的羊抗鼠IgG由河南省生物工程技术研究中心提供;MULTISKANMK3酶标仪购自Thermo公司;3326型CO2培养箱购自Form

4、a公司;硝酸纤维素膜（NC膜）购自Amersham公司;SDS-PAGE电泳仪购自BIO-RAD公司;BALB/c纯系雄性小鼠（鼠龄6～8周,体质量18～22g）购自中国医学科学院动物研究所。　　1.2方法　　1.2.1人工抗原的合成（1）免疫原的合成:称取4.4mgHis-tag和5mgOVA溶于1mLPB（0.05mol/L,pH7.0）中,充分溶解后,将200μL含有2.2mgEDC的PB溶液逐滴加入,边滴入边混匀,摇床100r/min反应4h,4℃静置过夜,用0.01mol/L,pH7.0PBS透析72h,存储于-

5、20℃备用。（2）包被抗原的合成:合成方法同免疫抗原的合成,载体蛋白为BSA。　　1.2.2杂交瘤细胞株的建立按本室常规方法免疫BALB/c小鼠（20～30μg/只）,末次免疫后免疫小鼠血清效价达到1∶10000以上,进行细胞融合,并以间接ELISA法筛选分泌抗His-tag的阳性克隆。克隆化及腹水制备,均按实验室常规方法进行。　　1.2.3mAb特性鉴定（1）效价测定:以BSA-His-tag（100ng/孔）包被ELISA板,腹水从1∶1000开始作10倍稀释。用间接ELISA法进行测定。（2）mAb特异性鉴定:用于抗

6、体交叉反应性研究的为常用蛋白标签,c-myc、多聚精氨酸、FLAG、钙调蛋白结合多肽、β-actin、谷胱甘肽S转移酶(GST)、葡萄球菌蛋白A(SPA)、麦芽糖结合蛋白、硫氧化还原蛋白及Ig的Fc段,用间接ELISA法测定。（3）抗体蛋白纯度测定:　抗体纯度测定采用SDS-PAGE凝胶电泳分析。（4）Ｉｇ类和亚类的鉴定:mAb类型及亚类鉴定采用双向琼脂扩散试验［2］和用兔抗小鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM酶标抗体的间接ELISA试验检测。　　1.2.4mAb在检测带His-tag的融合蛋白中

7、的初步应用（1）酶标抗体的制备及活性测定:酶标抗体的制备采用改良过碘酸钠法［3］。酶标抗体活性测定方法:将包被抗原用包被液稀释成100ng/孔包被96孔酶标板,4℃过夜,洗涤后分别加入梯度稀释的酶标抗体,37℃温育30min,洗涤;加底物显色20min,加终止液终止反应,用酶标仪测吸光值。取A值为1.0左右时所对应的酶标抗体稀释倍数为其效价。（2）融合蛋白的检测:采用蛋白印迹法对本基因工程实验室所纯化的带His-tag的基因工程蛋白进行检测［4］。　　2结果　　2.1杂交瘤细胞株的建立及mAb的特性鉴定获得1株高亲和力、高

8、特异性杂交瘤细胞,命名为3A-3。此株细胞经过多次传代、3次冻存及复苏,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。此株mAb经检测,腹水效价达到2×10-6;mAb经双向琼脂扩散试验和间接ELISA法检测为:IgG1;各种融合蛋白标签与His-tagmAb均无交叉反应性;SDS-PAGE电泳结果显示:抗体纯度≥90%。