破伤风类毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定

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1、破伤风类毒素单克隆抗体的制备及初步鉴定张秀昌刘芳崔萍孙黎罗强贾天军【摘要】目的：制备并鉴定破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，为破伤风的快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法：用破伤风类毒素做抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得分泌高滴度针对破伤风类毒素的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价，用间接ELISA和cAb)againsttetanictoxoid,todeveloparapidassayforTetanusandinvestigatethepathogenesisofthevirus.Methods:

2、BALB/cmousemunizedbypurifiedtetanictoxoid.Hybridomacelllinessecretingmonoclonalantibodies(McAbs)againsttetanictoxoidousespleniccellsacelllinessecretingmonoclonalantibodiesspecificallyagainsttetanictoxoidedas1E12,1E11and1G10.IndirectELISAandonoclonalnatibodies破伤风梭状杆菌是引起破伤风的病原菌，当机

3、体受到外伤，创口被污染，或分娩时使用不洁器械剪断脐带等，本菌可侵入局部创面而引起外源性感染，发芽繁殖，释放毒素,在发展中国家，新生儿破伤风死亡率可高达90%。目前对破伤风的诊断主要根据典型的症状和病史。单克隆抗体用于诊断感染性疾病具有灵敏度高、特异性强的特点，在许多疾病的诊断中已得到广泛应用。本实验首次成功制备破伤风类毒素单克隆抗体，为单抗应用于破伤风的临床诊断奠定了基础。1资料与方法1．1试剂、毒素、细胞与实验动物破伤风类毒素由北京生物制品监定所提供。福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂购自北京市普京康生物工程技术有限公司。BALB/C小鼠购自首都医科大学动

4、物室。SP2/0细胞由北京肿瘤研究所惠赠。聚乙二醇（PEG，ML）为抗原包被酶标板，封闭后加碱和杂交瘤细胞培养上清液37℃20min，洗涤后加HRP标记的羊抗鼠IgG（工作浓度1∶2000），37℃孵育20min后洗涤，加邻苯二胺（OPD）底物显色15min后终止反应。以上各步均以PBST洗涤3次，3min/次。同时设阴性、阳性和空白对照，筛选出能分泌抗体的杂交瘤细胞。1．5亚克隆化培养及腹水诱生筛选出阳性单抗后进行常规的有限稀释直至克隆细胞抗体阳性率为100%。对最后筛选出的三株阳性单克隆细胞进行扩大培养，同时对三株杂交瘤细胞进行反复冻存和复苏，每次

5、复苏后其培养上清液均做ELISA。复苏已建株的三株杂交瘤细胞经传代取对数生长期的细胞计数，小鼠腹腔接种5×105/只。一周后诱生采集并离心腹水得上清，用ELISA测抗体效价，置-20℃保存。1.6染色体鉴定秋水仙素处理传代培养单抗杂交瘤细胞，0.075mol/LKCL溶液低渗处定、铺片，10%Giemsa染色，镜检。1.7单克隆抗体亚类鉴定用鼠源性单克隆抗体亚型检测试剂盒（Sigma）鉴定。1.8免疫印迹（Westernblot）分析破伤风类毒素经SDSPAGE，转膜后分别与3株单抗的腹水进行Westernblot检测。2结果2.1杂交瘤细胞株的建立

6、将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，HAT培养基选择性培养，融合率为8%（32/396），抗体阳性率为9%（3/32）,经3次亚克隆，ELISA筛选，三株杂交瘤细胞获得稳定分泌抗破伤风类毒素单克隆抗体的性能。经免疫球蛋白亚类鉴定为IgG1亚类。培养上清效价为1∶6400，腹水效价为1∶12800。2.2杂交瘤细胞的克隆培养及腹水抗体诱生杂交瘤细胞在克隆化及扩大培养过程中经过3次克隆化、亚克隆后阳性克隆率为100%。3株杂交瘤细胞株分别定名为1G10、1E11、1E12,3株细胞在扩大培养及反复冻存复苏后，其分泌特异性抗体的能力能够持续保持。取杂

7、交瘤细胞5×105细胞悬液，对经不完全福氏佐剂预处理过的BALB/C小鼠作腹腔注射以诱生腹水。用ELISA检测到腹水抗体的最高稀释度为1∶12800。杂交瘤细胞增殖旺盛，经过反复复苏后细胞生长良好，分泌抗体性能稳定。2.3染色体鉴定正常BALB/C小鼠脾细胞染色体的数目恒定为40对；同品系的SP2/0细胞的染色体众数目为68对。杂交瘤细胞的染色体数目约为两种亲本染色体数目的总合，染色后计数为102对。2.4抗破伤风类毒素单抗亚类的鉴定纯化后的抗体用鼠源性单克隆抗体亚型检测试剂盒检测后显示，制备的抗破伤风类毒素单克隆抗体均为IgG1型。2.5].北京：

8、人民卫生出版社，2003.1831852曾德秀，杨芳，向鑫.新生儿破伤风流行病学调查[J