破伤风类毒素单克隆抗体制备及初步鉴定

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1、破伤风类毒素单克隆抗体制备及初步鉴定作者：张秀昌刘芳崔萍孙黎罗强贾天军【摘要】目的：制备并鉴定破伤风类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，为破伤风的快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法：用破伤风类毒素做抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得分泌高滴度针对破伤风类毒素的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价，用间接ELISA和Westernblot检测单克隆细胞株的特异性。结果：通过细胞融合和克隆化，筛选出3株持续分泌抗破伤风类毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E12、1E11、1G10。间接ELISA和Westernblot检测结果表明1E12、1E11、

2、1G10可以和破伤风类毒素发生特异性反应。结论：成功制备了抗破伤风类毒素单克隆抗体，为制备免疫诊断试剂盒和抗体药物的开发奠定了基础。【关键词】破伤风类毒素；杂交瘤；单克隆抗体[ABSTRACT]Objective：Toestablishandpreparehybridomacelllinesecretingmonoclonalantibody(McAb)againsttetanictoxoid,todeveloparapidassayforTetanusandinvestigatethepathogenesisofthevirus.Methods：BALB/cmousewasimm

3、unizedbypurifiedtetanictoxoid・Hybridomacelllinessecretingmonoclonalantibodies(McAbs)againsttetanictoxoidwerescreenedafterthefusionofmousespleniccellswithSP2/0cells・TheIgsubtypesandtiteroftheMcAbswereassayedwithELISAandWesternblotassay.Results：Aftercellfusionandsubcloning,threehybridomacellline

4、ssecretingmonoclonalantibodiesspecificallyagainsttetanictoxoidwereobtained,andrespectivelynamedas1E12,1E11and1G10.IndirectELISAandWesternblotassayshowedthattheMcAbs1E12,1E11and1G10couldspecificallyrecognizetetanictoxoid.Conclusion：ThespecificantitetanictoxoidMcAbsaredevelopedandtheseMcAbsmaybe

5、usefulinthedevelopmentofdetectionassayandbasicresearchofthepathogenesisofTetanus.[KEYWORDS]Tetanictoxoid；Hybridomacellline；Monoclonalnatibodies破伤风梭状杆菌是引起破伤风的病原菌，当机体受到外伤，创口被污染，或分娩时使用不洁器械剪断脐带等，本菌可侵入局部创面而引起外源性感染，发芽繁殖，释放毒素,在发展中国家，新生儿破伤风死亡率可高达90%。目前对破伤风的诊断主要根据典型的症状和病史。单克隆抗体用于诊断感染性疾病具有灵敏度高、特异性强的特点，在

6、许多疾病的诊断中已得到广泛应用。本实验首次成功制备破伤风类毒素单克隆抗体，为单抗应用于破伤风的临床诊断奠定了基础。1资料与方法1.1试剂、毒素、细胞与实验动物破伤风类毒素由北京生物制品监定所提供。福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂购自北京市普京康生物工程技术有限公司。BALB/C小鼠购自首都医科大学动物室。SP2/0细胞由北京肿瘤研究所惠赠。聚乙二醇(PEG,MW1000,)为天津天泰精细化学品有限公司产品。HAT为美国GIBCOBRL公司产品。羊抗鼠IgG酶标抗体为北京天象鑫龙生物医学科技有限公司进口分装产品。1.2小鼠免疫雌性、6周龄、17g左右BALB/C小鼠，后腿肌肉及背部皮内注

7、射破伤风类毒素免疫，第一次lOOug加等量福氏完全佐剂，3周后用100ug加等量福氏不完全佐剂，7周后500iig不加佐剂腹腔注射，腹腔注射后第4天进行细胞融合。1.3细胞融合腹腔注射后第4天取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%聚乙二醇作用下融合。融合后的杂交瘤细胞用含20%进口胎牛血清的HAT选择性培养基混均加入种有饲养细胞的96孔板中培养，2周后在倒置显微镜下挑选克隆孔。1.4ELISA筛选以破伤风类毒素（1.5/mL）为抗原包被酶标板，封闭后加碱和杂