蜈蚣提取物诱导宫颈癌hela细胞凋亡及其机制的研究

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1、蜈蚣提取物诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其机制的研究【摘要】目的研究蜈蚣提取物对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制及其作用机制。方法观察不同浓度的不同蜈蚣提取物对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制情况：运用体外细胞培养技术，以不同浓度的蜈蚣提取物以及阳性对照药顺铂作用于培养的HeLa细胞48h，采用MTT法测定细胞代谢率，以流式细胞术观察DNA含量和凋亡的变化情况，DNA片断化分析和ethodsToobserveinhibitory-effectofdifferentconcentrationextractonthe

2、groethodMTTtodetectcellsurvivalrate,byfloetrytoobservethechangeofDNAcycleandapoptosisandtoassaytheDNAfragmentationanddetecttheprotEinBax，caspase3byI-1640培养基为美国Gibco产；小牛血清为杭州四季青产品；噻唑蓝(MTT)为Sigma进口分装；DNA检测试剂盒为美国Coulter产品；鼠抗人Bax,Caspase3的单克隆抗体(单抗)为美国SantaCr

3、uz公司产品。　　1.1.2仪器及材料酶标仪，瑞士Tecan产，GENios型；流式细胞仪，美国BeckmanCoulter产，EPICSXL-4型；CO2培养箱，日本Sanyo产，MDF-75型；凝胶成像系统，美国Kodak公司产，GelLogic200型；转移脱色摇床，海门市林其贝尔仪器公司产，TS-8型；电泳仪，北京六一仪器厂，DYY-6C型；96孔和6孔板均为美国CorningCostar产品。　　1.2方法　　1.2.1蜈蚣提取物的制备醚提物：取多棘蜈蚣干燥虫体200g，磨碎后于2000ml烧

4、瓶中加乙醚1000ml,35℃水浴回流4h，再超声波破碎20min，并用冰块降温（防止温度过高致蛋白变性和乙醚大量挥发而发生爆炸）。抽滤后滤液35℃下旋转蒸发回收乙醚,乙醚挥发完后剩下为蜈蚣的脂提物。残渣再用上述方法用乙醚提取两次,收集脂提物，合并置4℃冰箱中储存备用。　　醇提物：乙醚提取后的残渣于500ml三角瓶中，每瓶70g，加入30%的乙醇溶液200ml,以120r/min浸提4h，超声波破碎20min用冰块降温,抽滤得滤液，残渣再重复提取3次。滤液在40℃真空旋转使乙醇挥发完，后进行冷冻干燥得醇

5、提物冻干粉，置冰箱中保存。　　1.2.2MTT法测定药物对HeLa细胞增殖的影响取对数生长的HeLa细胞以1×104/ml×200μl/孔的接种量，在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液的条件下，接种于96孔培养板，5%CO2，37℃，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24h。后分别加入生理盐水、顺铂（5，20，40μg/ml）、蜈蚣醚和醇提取物（4，8，16mg/ml）40μl/孔混匀，各有6个平行孔，继续培养48h，终止培养弃上清，PBS洗涤2次后加入无血清RPMI-1640培养液稀释的MTT（终

6、浓度0.2mg/ml）混合液200μl/孔，继续5%CO2，37℃孵育4h，吸弃培养液,加入DMSO200μl/孔，在漩涡振荡器上混匀，10～30min内在酶标仪492nm读板得吸光度OD值，根据测得的OD值按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。　　1.2.3流式细胞仪分析细胞各周期DNA含量变化及亚G1凋亡峰测定取对数生长的HeLa细胞以1×105/ml×2ml/孔的接种量，在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液的条件下，接种于6孔培养板，5

7、%CO2，37℃温箱中培养24h。后分别加入生理盐水、顺铂（5，20，40μg/ml）、蜈蚣醚和醇提取物（4，8，16mg/ml）400μl/孔混匀，各有3个平行孔，继续培养48h后，收集上清，与用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液收集的细胞悬液合并，用1×PBS以1000r/min,离心5min洗涤3次，调整细胞浓度为1×106/ml。严格按照DNA试剂盒说明书操作，取上述细胞悬液100μl，先加入200μl打孔、破膜剂混匀，10s后再加入2ml含RNase的PI染液混匀，室温暗处避光孵

8、育染色20min，经300目尼龙网过滤后上流式细胞仪分析细胞周期和凋亡改变情况。结果用软件DNAMultictycle分析。　　1.2.4DNA片断化分析取对数生长的HeLa细胞以1×105/ml×10ml/瓶的接种量，在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液的条件下，接种于250ml培养瓶，5%CO2，37℃温箱中培养24h。后分别加入生理盐水、顺铂（5，20，40μg/ml）、蜈蚣醚和醇提取物（4，8，16mg/ml）2ml/瓶混匀