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时间:2018-05-04
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1、他莫昔芬对人肝癌细胞增殖及ER表达影响的研究作者:白文坤 王文奇 时昌文 吴洪文【摘要】目的:研究他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)对人肝癌HepG2细胞增殖和HepG2细胞ER表达的影响。方法:按照TAM的浓度不同分为7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L3组,对照组不加TAM,每孔加入1×105mL-1细胞0.1mL,培养24、48和72h,采用MTT法测定抑制率;细胞免疫组化染色观察TAM对肝癌细胞ER的表达的影响。结果:TAM抑制人肝癌细胞增殖及ER表达,并具有时间-浓度依赖。结论:TAM可能通过影响肝癌细胞ER
2、的表达抑制肝癌细胞增殖。【关键词】肝肿瘤·细胞增殖·他莫昔芬·受体,雌激素【ABSTRACT】Objective:TostudytheeffectsoftamoxifenonproliferationandERexpressionofhumanhepatocellularcarcinomacells.Methods:HepG2cellsoxifenatdifferentconcentrationanddifferentactiontime.MTTinethesuppressionrateof 他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)是一种非
3、甾体类抗雌激素药物,应用于肝癌治疗具有一定疗效[1],但作用机制尚未阐明。本研究通过检测人肝癌HepG2细胞在TAM作用前后增殖活性变化及雌激素受体(estrogenreceptor,ER)阳性表达的变化,探讨TAM在肝癌治疗中的作用机制。1 材料与方法1.1 实验材料 人肝癌细胞HepG2(山东省普外学科重点实验室提供);即用型鼠抗人ER单克隆抗体(美国Sigma公司)。1.2 细胞培养 将人肝癌HepG2细胞株常规培养于RPMI1640培养液中(内加10%小牛血清),培养液中加入青霉素(浓度100U/mL)和链霉素(浓度100μg/mL
4、),37℃、5%CO2培养箱中培养。1.3 分组 按照TAM的浓度不同分为7.5、15、30μmol/L及0μmol/L(对照组)4组,每组设6个平行孔。1.4 MTT实验 取对数生长期HepG2细胞,用RPMI1640培养液调整细胞数为1×105mL-1,加入96孔培养板,每孔0.1mL,37℃、5%CO2培养箱中过夜,待细胞贴壁约70%~80%时,弃去细胞培养液,分别加入不同浓度的TAM0.1mL,培养20、44和68h,每孔加入MTT10μL,继续培养4h,将培养液弃去,加入DMSO150μL/孔,振荡10~15min,在492nm处
5、测定OD值,计算抑制率: 抑制率(%)=(1-实验孔OD/对照孔OD)×100%1.5 ER免疫组织化学染色 将对数生长期的细胞传代后置于6孔板中培养,培养液中分别加入不同浓度的TAM,培养20、44、68h,放入载玻片,再培养4h,置载玻片于4℃甲醇和丙酮混合液(1:1)中20min,使细胞固定,PBS液清洗3×3min,清洗3次,甩去PBS液,每张载玻片加入50μL的非免疫性动物血清封闭,置37℃温箱中孵育30min。采用SP法进行免疫组织化学染色。分别在每张载玻片加入50μL即用型鼠抗人雌激素受体单克隆抗体即第一抗体,4℃过夜;加入
6、50μL生物素标记的第二抗体,37℃孵育1h后加入50μL链亲和素-过氧化物酶溶液即第三抗体,37℃孵育40min;加入100μL新鲜配制的DAB显色剂显色,苏木精复染,1%盐酸乙醇分色,梯度乙醇脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封片。1.6 结果判定 ER阳性结果为细胞核棕黄色着色。高倍镜(×400)下计数500个细胞中染色阳性细胞数,计算ER平均阳性表达率。1.7 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件进行方差分析,以P≤0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 TAM作用后对肝癌细胞的影响 TAM对人肝癌细胞抑制率的影响呈明显时间-
7、浓度依赖(F时间=140.234,P=0.000;F浓度=44.031,P=0.002),时间的影响更明显。随着TAM作用时间延长,TAM对HepG2细胞的抑制作用逐渐加强,24、48和72h组之间相比差异均有统计学意义(均P<0.05);不同浓度TAM组人肝癌细胞抑制率较对照组均明显增高(均P<0.05),30μmol/L组72h抑制率最高,见表1。2.2 TAM对人肝癌细胞ER阳性表达的影响 TAM对ER阳性率的影响呈明显时间-浓度依赖(F时间=70.040,P=0.001;F浓度=27.992,P=0.004),时间的影响更明显。24
8、、48和72h组ER阳性率下降,且差异有统计学意义(均P<0.05);不同浓度TAM对HepG2细胞ER的阳性率均有抑制作用,人肝癌细胞ER的阳性率均较对照组明显降低(均P<0.
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