他莫昔芬对人肝癌细胞增殖及er表达影响的研究

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1、他莫昔芬对人肝癌细胞增殖及ER表达影响的研究作者：白文坤　王文奇　时昌文　吴洪文【摘要】目的：研究他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）对人肝癌HepG2细胞增殖和HepG2细胞ER表达的影响。方法：按照TAM的浓度不同分为7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L3组，对照组不加TAM，每孔加入1×105mL-1细胞0.1mL，培养24、48和72h，采用MTT法测定抑制率；细胞免疫组化染色观察TAM对肝癌细胞ER的表达的影响。结果：TAM抑制人肝癌细胞增殖及ER表达，并具有时间-浓度依赖。结论：TAM可能通过影响肝癌细胞ER

2、的表达抑制肝癌细胞增殖。【关键词】肝肿瘤·细胞增殖·他莫昔芬·受体，雌激素【ABSTRACT】Objective:TostudytheeffectsoftamoxifenonproliferationandERexpressionofhumanhepatocellularcarcinomacells.Methods:HepG2cellsoxifenatdifferentconcentrationanddifferentactiontime.MTTinethesuppressionrateof　　他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)是一种非

3、甾体类抗雌激素药物，应用于肝癌治疗具有一定疗效［1］，但作用机制尚未阐明。本研究通过检测人肝癌HepG2细胞在TAM作用前后增殖活性变化及雌激素受体（estrogenreceptor，ER）阳性表达的变化，探讨TAM在肝癌治疗中的作用机制。1　材料与方法1.1　实验材料　人肝癌细胞HepG2（山东省普外学科重点实验室提供）；即用型鼠抗人ER单克隆抗体（美国Sigma公司）。1.2　细胞培养　将人肝癌HepG2细胞株常规培养于RPMI1640培养液中（内加10%小牛血清），培养液中加入青霉素（浓度100U/mL）和链霉素（浓度100μg/mL

4、）,37℃、5%CO2培养箱中培养。1.3　分组　按照TAM的浓度不同分为7.5、15、30μmol/L及0μmol/L（对照组）4组，每组设6个平行孔。1.4　MTT实验　取对数生长期HepG2细胞，用RPMI1640培养液调整细胞数为1×105mL-1，加入96孔培养板，每孔0.1mL，37℃、5%CO2培养箱中过夜，待细胞贴壁约70%~80%时，弃去细胞培养液，分别加入不同浓度的TAM0.1mL，培养20、44和68h，每孔加入MTT10μL，继续培养4h，将培养液弃去，加入DMSO150μL/孔，振荡10～15min，在492nm处

5、测定OD值，计算抑制率：　　抑制率（%）＝（1-实验孔OD/对照孔OD）×100%1.5　ER免疫组织化学染色　将对数生长期的细胞传代后置于6孔板中培养，培养液中分别加入不同浓度的TAM，培养20、44、68h，放入载玻片，再培养4h，置载玻片于4℃甲醇和丙酮混合液（1:1）中20min，使细胞固定，PBS液清洗3×3min，清洗3次，甩去PBS液，每张载玻片加入50μL的非免疫性动物血清封闭，置37℃温箱中孵育30min。采用SP法进行免疫组织化学染色。分别在每张载玻片加入50μL即用型鼠抗人雌激素受体单克隆抗体即第一抗体，4℃过夜；加入

6、50μL生物素标记的第二抗体，37℃孵育1h后加入50μL链亲和素-过氧化物酶溶液即第三抗体，37℃孵育40min；加入100μL新鲜配制的DAB显色剂显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分色，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。1.6　结果判定　ER阳性结果为细胞核棕黄色着色。高倍镜（×400）下计数500个细胞中染色阳性细胞数，计算ER平均阳性表达率。1.7　统计学处理　采用SPSS13.0统计学软件进行方差分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。2　结果２.1　TAM作用后对肝癌细胞的影响　TAM对人肝癌细胞抑制率的影响呈明显时间-

7、浓度依赖（F时间=140.234,P=0.000；F浓度=44.031，P=0.002），时间的影响更明显。随着TAM作用时间延长，TAM对HepG2细胞的抑制作用逐渐加强，24、48和72h组之间相比差异均有统计学意义（均P＜0.05）；不同浓度TAM组人肝癌细胞抑制率较对照组均明显增高（均P＜0.05），30μmol/L组72h抑制率最高，见表1。2．2　TAM对人肝癌细胞ER阳性表达的影响　TAM对ER阳性率的影响呈明显时间－浓度依赖（F时间=70.040,P=0.001；F浓度=27.992，P=0.004），时间的影响更明显。24

8、、48和72h组ER阳性率下降，且差异有统计学意义（均P＜0.05）；不同浓度TAM对HepG2细胞ER的阳性率均有抑制作用,人肝癌细胞ER的阳性率均较对照组明显降低（均P＜0.