他莫昔芬对人肝癌细胞增殖及ER表达影响探究

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1、他莫昔芬对人肝癌细胞增殖及ER表达影响探究作者：白文坤王文奇时昌文吴洪文【摘要】目的：研究他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)对人肝癌HepG2细胞增殖和HepG2细胞ER表达的影响。方法：按照TAM的浓度不同分为7.5umol/L.15umol/L、30umol/L3组，对照组不加TAM,每孔加入1X105mL-1细胞0.ImL,培养24、48和72h,采用MTT法测定抑制率；细胞免疫组化染色观察TAM对肝癌细胞ER的表达的影响。结果：TAM抑制人肝癌细胞增殖及ER表达，并具有时间-浓度依赖。结论：TAM可能通过影响肝癌细胞E

2、R的表达抑制肝癌细胞增殖。【关键词】肝肿瘤•细胞增殖•他莫昔芬•受体，雌激素[ABSTRACT】Objective：TostudytheeffectsoftamoxifenonproliferationandERexpressionofhumanhepatocellularcarcinomacells・Methods：HepG2cellsweretreatedwithtamoxifenatdifferentconcentrationanddifferentactiontime.MTTwasusedtodeterminethesup

3、pressionrateof他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)是一种非笛体类抗雌激素药物，应用于肝癌治疗具有一定疗效[1],但作用机制尚未阐明。本研究通过检测人肝癌HepG2细胞在TAM作用前后增殖活性变化及雌激素受体（estrogenreceptor,ER）阳性表达的变化，探讨TAM在肝癌治疗中的作用机制。1材料与方法1.1实验材料人肝癌细胞HepG2（山东省普外学科重点实验室提供）；即用型鼠抗人ER单克隆抗体（美国Sigma公司）。1.2细胞培养将人肝癌HepG2细胞株常规培养于RPMI1640培养液中（内加10%小牛血清

4、），培养液中加入青霉素（浓度100U/mL）和链霉素（浓度100Hg/mL）,37°C.5%C02培养箱中培养。1.3分组按照TAM的浓度不同分为7.5、15、30umol/L及0umol/L（对照组）4组，每组设6个平行孔。1.4MTT实验取对数生长期HepG2细胞，用RPMI1640培养液调整细胞数为1X105mL-l,加入96孔培养板，每孔0.1mL,37°C、5%C02培养箱中过夜，待细胞贴壁约70%~80%时，弃去细胞培养液，分别加入不同浓度的TAM0.1mL,培养20、44和68h,每孔加入MTT10uL,继续培养4h

5、,将培养液弃去，加入DMS0150uL/孔，振荡10〜15min,在492nm处测定0D值，计算抑制率：抑制率（%）=（1-实验孔0D/对照孔OD）X100%1.5ER免疫组织化学染色将对数生长期的细胞传代后置于6孔板中培养，培养液中分别加入不同浓度的TAM,培养20、44、68h,放入载玻片，再培养4h,置载玻片于4"甲醇和丙酮混合液（1:1）中20min,使细胞固定，PBS液清洗3X3min,清洗3次，甩去PBS液，每张载玻片加入50uL的非免疫性动物血清封闭,置37工温箱中孵育30mino采用SP法进行免疫组织化学染色。分别

6、在每张载玻片加入50uL即用型鼠抗人雌激素受体单克隆抗体即第一抗体,41过夜；加入50uL生物素标记的第二抗体，37°C孵育1h后加入50uL链亲和素-过氧化物酶溶液即第三抗体，37°C孵育40min；加入100uL新鲜配制的DAB显色剂显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分色，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。1.6结果判定ER阳性结果为细胞核棕黄色着色。高倍镜（X400）下计数500个细胞中染色阳性细胞数，计算ER平均阳性表达率。1.7统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行方差分析，以PW0.05为差异有统计学意义。

7、2结果2.1TAM作用后对肝癌细胞的影响TAM对人肝癌细胞抑制率的影响呈明显时间-浓度依赖（F时间=140.234,P=0.000；F浓度=44.031,P=0.002）,时间的影响更明显。随着TAM作用时间延长，TAM对HepG2细胞的抑制作用逐渐加强，24、48和72h组之间相比差异均有统计学意义（均P<0.05）；不同浓度TAM组人肝癌细胞抑制率较对照组均明显增高（均P<0.05）,30umol/L组72h抑制率最高，见表lo2.2TAM对人肝癌细胞ER阳性表达的影响TAM对ER阳性率的影响呈明显时间一浓度依赖（F时间=70

8、.040,P=0.001；F浓度=27.992,P=0.004）,时间的影响更明显。24、48和72h组ER阳性率下降，且差异有统计学意义（均P<0.05）；不同浓度TAM对HepG2细胞ER的阳性率均有抑制作用，人肝癌细胞ER的阳性率均较对照组明