柿est—ssr标记在柿属植物中的通用性研究

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1、柿EST—SSR标记在柿属植物中的通用性研究柿ESTSSR标记在柿属植物中的通用性研究简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子标记技术通常又称为微卫星标记（Microsatellites），它是指以1～6个核苷酸为单位多次串联重复的DNA序列。与其他分子标记技术相比，SSR标记具有多态性高、共显特性、易用聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR）检测、重复性强、数量丰富和对基因组有很好的覆盖性等特点[1]。根据SSR的来源可将其分为基因组SSR和表达序列标签（

2、Expressedsequencetag，EST）-SSR。EST是来自随机选取的特定处理的cDNA克隆末端序列，能反映mRNA的信息，在功能基因组研究中具有重要意义。EST-SSR与基因组SSR标记相比，具有不同物种间通用性较好、开发方法简单及成本低廉等优点[2]。而且EST-SSR标记来自于基因的编码序列，更容易获得基因表达的信息，所以现在已成为重要的农作物农艺性状定位、遗传作图、遗传多样性、比较基因组学研究的新型工具。目前，大麦（HordeumvulgareL.）[3]、小麦（TriticumaestivumL.

3、）[3]、油菜（BrassicacampestrisL.）[4]、柑橘（CitrusreticulataBlanco）[5]等许多农作物已从公共数据库中成功地开发出了大量的EST-SSR标记。　　柿（DiospyroskakiThunb.）是柿科（Ebenaceae）柿属（DiospyrosL.）植物中作为果树栽培的代表种，其栽培历史已有二千余年。中国是柿属植物的分布中心和原产中心之一，拥有丰富的种质资源。目前，已利用多本文由.LgCl2，0.1mmol/LdNTPs，0.8μmol/L引物，1UTaq酶。扩增反

4、应是在德国BiometraTProfessionalPCR仪上进行，扩增程序如下：94℃预变性2min；94℃变性45s，55℃（不同引物退火温度不同）复性1min，72℃延伸75s，35个循环；72℃延伸5min。试验所用引物序列的基本信息及各引物退火温度见表2。　　1.3凝胶电泳及银染　　SSR扩增产物通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行银染[11，12]，用数码相机拍照保存电泳图谱。根据图谱分析各EST-SSR位点的扩增情况，包括是否扩增、各位点在不同种中所得到的等位基因数量，根据DNA分子量标准估算等位基因

5、片段的大小。　　1.4遗传多样性分析　　对11个柿EST-SSR位点在20份柿近缘种中的扩增结果DNA谱带进行数字化统计，有带的位置记为1，无带的位置记为0。将所有试验数据在MicrosftOfficeExcel2003软件里进行标准化处理，利用NTSYSpc2.10e分析软件构建数据矩阵；在Simint程序下选择Dice系数计算20份柿近缘种间的遗传相似系数，采用非加权组平均法（Unethodeticmeans，UPGMA）建立相应的系统树状树，通过聚类划分类群来完成聚类分析。　　2结果与分析　　2.1柿EST-SS

6、R引物在柿近缘种中的扩增结果　　11对柿EST-SSR引物在20份柿近缘种中的扩增结果分别见表3、图1。由表3可以看出，在所有的11对EST-SSR引物中，以引物1430、5845与5553的通用性最高，可在所有20份柿近缘种材料中得到扩增片段；而其他8对引物都在某些材料中没有扩增产物出现，如引物460在丽江君迁子1以外的其他近缘种中都得到了扩增产物；引物6665也有较高的通用性，除了在丽江君迁子1和丽江君迁子4中没有得到扩增产物外，在其他的近缘种中都得到了清晰的扩增条带。引物8125、4379和9004在3个近缘种中

7、无扩增产物。引物1554、6615、8917在4个近缘种中无扩增产物，通用性稍低。2.2EST-SSR扩增图谱分析　　对11个EST-SSR位点在20份柿属植物中的扩增图谱（图1）进行分析。结果表明，在扩增与否和各位点扩增的等位基因数量方面，不同种间存在着差异。从EST-SSR位点的扩增情况来看，丽江君迁子1除了引物1430、5845、8125和5553可得到目的扩增产物外，在其他7个位点中均无扩增产物，可扩增位点较少；乌材、丽江君迁子4和丽江君迁子6分别得到7、6、7个可扩增位点；青茶柿、象牙树、丽江君迁子3和苗山柿

8、各自除一个位点外，其他10个位点均能有效扩增；其他12份近缘种材料在所供试的EST-SSR位点均有目的产物扩增出来。　　从表3各EST-SSR位点所得到的等位基因数目来看，各近缘种所得到的等位基因数目差异较小。各个近缘种材料在8917、1430位点上扩增得到的等位基因数较多，其中，岭南柿在8917位点上得到等位基因数目最多，为8个