人原发性胆囊癌单克隆抗体制备及其特异性研究

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1、人原发性胆囊癌单克隆抗体制备及其特异性研究【摘要】　　目的　制备人原发性胆囊癌单克隆抗体，对其特异性进行研究。方法　以胆囊癌细胞系SGC-996免疫Balb/c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得稳定分泌抗SGC-996单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。结果　杂交瘤细胞符合融合细胞核型特点，有较强的成瘤性。抗体亚类为IgG1。相对应的抗原主要表达在胞质和胞核中，分子量约为67kD。抗体对胆囊癌有较强的免疫反应，其他癌组织、癌旁组织及间质、正常胆囊上皮和成纤维细胞均呈阴性。结论　建立一株杂交瘤细胞系，能稳定分泌单克隆抗体，

2、该抗体具有较高特异性。【关键词】胆囊癌；杂交瘤；单克隆抗体；免疫组织化学/免疫细胞化学Abstract：ObjectiveTopreparemonoclonalantibody(McAb)againsthumangallbladdercarcinomaantigenandtolayafoundationforfurtherstudyofthetumour,clinicaldiagnosisanddrug-guidedtreatment.MethodsBalb/cmicemunizedangallbladderca

3、rcinomacells.Thelymphocyteshybridomatechniquemunohistochemistry(IHC),immunocytochemistry（ICC）andcAbolecularandkaryonofSGC-996.TheICCresultsshoaandnegativetogastriccarcinoma，colorectalcarcinoma，hepatocellularcarcinoma,esophagealcarcinomaandnon-digestivetracttu

4、mor.ConclusionThehybridomacelllinecanbepreparedtosecretestablymonoclonalantibodyagainsthumangallbladdercarcinoma.Itcouldreactspecificiallya.KeyangallbladderCarcinoma;Hybridoma;MonoclonalAntibody;Immunohistochemistry;Immunocytochemistry原发性胆囊癌(primarycarcinomao

5、fthegallbladder，PCG)是胆道系统常见的恶性肿瘤，早期无特殊症状，给胆囊癌的诊断，尤其是早期诊断，带来很大困难。寻找原发性胆囊癌特异性肿瘤标志物，为胆囊癌的早期诊断及预后提供可靠、准确的判断指标，已成为研究原发性胆囊癌生物学行为的重要环节。本研究以人原发性胆囊腺癌细胞株为免疫原，制备该细胞株单克隆抗体，并对其特异性进行了研究。1　材料与方法1.1　实验动物Balb/c小鼠，雌性，9～12周龄，购自第二军医大学实验动物中心。1.2　组织与细胞株胆囊癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肺成纤维细胞，由同济大学肿

6、瘤研究中心提供；SP2/0骨髓瘤细胞，购自中科院上海细胞所。病理组织切片取自同济大学附属同济医院。1.3　主要试剂PEG1500、HAT、HT购自SIGMA公司；SABC免疫组化试剂盒购自华美公司；小鼠单抗免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒购自晶美公司。1.4　方法成1.4.1　单克隆抗体制备采用9～12周龄雌性Balb／c小鼠，以5×105SGC-996胆囊癌细胞免疫3次，每次间隔2周，前两次为腹腔注射，末次为尾静脉注射［1］。末次免疫后3天取脾细胞；与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0以5∶1比例在50％PEG1500作用下进行

7、融合。用含HAT的DMEM培养液在96孔板中选择培养，当杂交瘤细胞长满孔底2/3，取上清液用ABS-ELISA法进行克隆筛选，选择对SGC-996细胞呈强阳性反应的克隆，扩大培养于含20％小牛血清的DMEM培养基和5％CO2的孵箱中，部分冻存［2］。1×105杂交瘤细胞接种于注射过石蜡的Balb／c小鼠腹腔中，7天后获得富含单抗的腹水。1.4.2　单克隆抗体鉴定杂交瘤细胞核型分析、腹水型McAb效价测定按2　结果2.1　杂交瘤细胞株建立融合细胞生长情况良好（图1），采用ABS-ELISA法筛选，选取OD值较高而细

8、胞数量较少的孔进行亚克隆，经4次亚克隆筛选抗体阳性率逐次图1　融合后7天杂交瘤细胞　×400Fig.1　hybridomacells×400(sevendaysafterbination)提高，达100％。选一株持续分泌单抗并且滴度最高的杂交瘤，命名为4E6。核型分析显示（图2），图2　杂交瘤细胞染色体　×400Fig.2　TheChromosomalmorphology