人原发性胆囊癌单克隆抗体制备及其特异性研究论文

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1、人原发性胆囊癌单克隆抗体制备及其特异性研究论文【摘要】目的制备人原发性胆囊癌单克隆抗体，对其特异性进行研究。方法以胆囊癌细胞系SGC-996免疫Balb/c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得稳定分泌抗SGC-996单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。结果杂交瘤细胞符合融合细胞核型特点，有较强的成瘤性。抗体亚类为IgG1。相对应的抗原主要表达在胞质和胞核中，分子量约为67kD。抗体对胆囊癌有较强的免疫反应，其他癌组织、癌旁组织及间质、正常胆囊上皮和成纤维细胞均呈阴性。结论建立一株杂交瘤细胞系，能稳定分泌单克隆抗体.

2、freelonoclonalantibody(McAb)againsthumangallbladdercarcinomaantigenandtolayafoundationforfurtherstudyofthetumour,clinicaldiagnosisanddrug-guidedtreatment.MethodsBalb/cmicemunizedangallbladdercarcinomacells.Thelymphocyteshybridomatechniquemunohistochemistr

3、y(IHC),.freelmunocytochemistry（ICC）andcAbolecularandkaryonofSGC-996.TheICCresultsshoaandnegativetogastriccarcinoma，colorectalcarcinoma，hepatocellularcarcinoma,esophagealcarcinomaandnon-digestivetracttumor.ConclusionThehybridomacelllinecanbepreparedtosecre

4、testablymonoclonalantibodyagainsthumangallbladdercarcinoma.Itcouldreactspecificiallya.KeyangallbladderCarcinoma;Hybridoma;MonoclonalAntibody;Immunohistochemistry;Immunocytochemistry原发性胆囊癌(primarycarcinomaofthegallbladder，PCG)是胆道系统常见的恶性肿瘤，早期无特殊症状，给胆囊癌的诊断，尤

5、其是早期诊断，带来很大困难。寻找原发性胆囊癌特异性肿瘤标志物，为胆囊癌的早期诊断及预后提供可靠、准确的判断指标，已成为研究原发性胆囊癌生物学行为的重要环节。本研究以人原发性胆囊腺癌细胞株为免疫原，制备该细胞株单克隆抗体，并对其特异性进行了研究。1材料与方法1.1实验动物Balb/c小鼠，雌性，9～12周龄，购自第二军医大学实验动物中心。1.2组织与细胞株胆囊癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肺成纤维细胞，由同济大学肿瘤研究中心提供；SP2/0骨髓瘤细胞，购自中科院上海细胞所。病理组织切片取自同济大学附属同济医院。

6、1.3主要试剂PEG1500、HAT、HT购自SIGMA公司；SABC免疫组化试剂盒购自华美公司；小鼠单抗免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒购自晶美公司。1.4方法成1.4.1单克隆抗体制备采用9～12周龄雌性Balb／c小鼠，以5×105SGC-996胆囊癌细胞免疫3次，每次间隔2周，前两次为腹腔注射，末次为尾静脉注射［1］。末次免疫后3天取脾细胞；与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0以5∶1比例在50％PEG1500作用下进行融合。用含HAT的DMEM培养液在96孔板中选择培养，当杂交瘤细胞长满孔底2/3，取上清液用AB

7、S-ELISA法进行克隆筛选，选择对SGC-996细胞呈强阳性反应的克隆，扩大培养于含20％小牛血清的DMEM培养基和5％CO2的孵箱中，部分冻存［2］。1×105杂交瘤细胞接种于注射过石蜡的Balb／c小鼠腹腔中，7天后获得富含单抗的腹水。1.4.2单克隆抗体鉴定杂交瘤细胞核型分析、腹水型McAb效价测定按文献报道［3，4］的方法进行。McAb免疫球蛋白类型及亚类鉴定参照试剂盒说明书操作。1.4.3免疫细胞化学和免疫组织化学染色参照常规SABC法进行。切片抗原修复，放于0.01M枸橼酸钠缓冲液中，煮沸1

8、0min。本实验共检测细胞株7种，肿瘤组织切片47例。1.4.4单抗识别抗原的提取和分析以膀胱癌细胞为对照，取对数生长期SGC-996细胞及EJ膀胱癌细胞，用PBS冲洗细胞后，加入细胞裂解液，置冰上放置20min后，用刮匙将细胞从瓶壁上刮下；在4℃条件下，10000r离心20min；取含蛋白质的上清液，常规方法行SDS-PAGE和cAb4E6-ELISA法测定培养上清液及腹水的效价均大于1∶128000，效价较高。免疫组织化学