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时间:2018-11-20
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1、人原发性胆囊癌单克隆抗体制备及其特异性研究论文【摘要】目的制备人原发性胆囊癌单克隆抗体,对其特异性进行研究。方法以胆囊癌细胞系SGC-996免疫Balb/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,获得稳定分泌抗SGC-996单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。结果杂交瘤细胞符合融合细胞核型特点,有较强的成瘤性。抗体亚类为IgG1。相对应的抗原主要表达在胞质和胞核中,分子量约为67kD。抗体对胆囊癌有较强的免疫反应,其他癌组织、癌旁组织及间质、正常胆囊上皮和成纤维细胞均呈阴性。结论建立一株杂交瘤细胞系,能稳定分泌单克隆抗体.
2、freelonoclonalantibody(McAb)againsthumangallbladdercarcinomaantigenandtolayafoundationforfurtherstudyofthetumour,clinicaldiagnosisanddrug-guidedtreatment.MethodsBalb/cmicemunizedangallbladdercarcinomacells.Thelymphocyteshybridomatechniquemunohistochemistr
3、y(IHC),.freelmunocytochemistry(ICC)andcAbolecularandkaryonofSGC-996.TheICCresultsshoaandnegativetogastriccarcinoma,colorectalcarcinoma,hepatocellularcarcinoma,esophagealcarcinomaandnon-digestivetracttumor.ConclusionThehybridomacelllinecanbepreparedtosecre
4、testablymonoclonalantibodyagainsthumangallbladdercarcinoma.Itcouldreactspecificiallya.KeyangallbladderCarcinoma;Hybridoma;MonoclonalAntibody;Immunohistochemistry;Immunocytochemistry原发性胆囊癌(primarycarcinomaofthegallbladder,PCG)是胆道系统常见的恶性肿瘤,早期无特殊症状,给胆囊癌的诊断,尤
5、其是早期诊断,带来很大困难。寻找原发性胆囊癌特异性肿瘤标志物,为胆囊癌的早期诊断及预后提供可靠、准确的判断指标,已成为研究原发性胆囊癌生物学行为的重要环节。本研究以人原发性胆囊腺癌细胞株为免疫原,制备该细胞株单克隆抗体,并对其特异性进行了研究。1材料与方法1.1实验动物Balb/c小鼠,雌性,9~12周龄,购自第二军医大学实验动物中心。1.2组织与细胞株胆囊癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肺成纤维细胞,由同济大学肿瘤研究中心提供;SP2/0骨髓瘤细胞,购自中科院上海细胞所。病理组织切片取自同济大学附属同济医院。
6、1.3主要试剂PEG1500、HAT、HT购自SIGMA公司;SABC免疫组化试剂盒购自华美公司;小鼠单抗免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒购自晶美公司。1.4方法成1.4.1单克隆抗体制备采用9~12周龄雌性Balb/c小鼠,以5×105SGC-996胆囊癌细胞免疫3次,每次间隔2周,前两次为腹腔注射,末次为尾静脉注射[1]。末次免疫后3天取脾细胞;与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1比例在50%PEG1500作用下进行融合。用含HAT的DMEM培养液在96孔板中选择培养,当杂交瘤细胞长满孔底2/3,取上清液用AB
7、S-ELISA法进行克隆筛选,选择对SGC-996细胞呈强阳性反应的克隆,扩大培养于含20%小牛血清的DMEM培养基和5%CO2的孵箱中,部分冻存[2]。1×105杂交瘤细胞接种于注射过石蜡的Balb/c小鼠腹腔中,7天后获得富含单抗的腹水。1.4.2单克隆抗体鉴定杂交瘤细胞核型分析、腹水型McAb效价测定按文献报道[3,4]的方法进行。McAb免疫球蛋白类型及亚类鉴定参照试剂盒说明书操作。1.4.3免疫细胞化学和免疫组织化学染色参照常规SABC法进行。切片抗原修复,放于0.01M枸橼酸钠缓冲液中,煮沸1
8、0min。本实验共检测细胞株7种,肿瘤组织切片47例。1.4.4单抗识别抗原的提取和分析以膀胱癌细胞为对照,取对数生长期SGC-996细胞及EJ膀胱癌细胞,用PBS冲洗细胞后,加入细胞裂解液,置冰上放置20min后,用刮匙将细胞从瓶壁上刮下;在4℃条件下,10000r离心20min;取含蛋白质的上清液,常规方法行SDS-PAGE和cAb4E6-ELISA法测定培养上清液及腹水的效价均大于1∶128000,效价较高。免疫组织化学
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