免疫电镜技术运用过程中电子染色方法的选用

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1、免疫电镜技术运用过程中电子染色方法的选用作者：赵承军，张东梅，邓其跃，陈鹏慧，蔡文琴，陶忠芬，张吉强【摘要】目的探究免疫电镜不同染色方法对免疫组化阳性实验结果影响的关系。方法组织切片经常规免疫组化（雌激素受体GPR30）并行DAB-硫酸镍铵显色后进行电镜切片，然后分为双氧铀-柠檬酸铅双染、双氧铀单染与未染色3组，以便对不同电子染色结果进行比较。结果GPR30免疫阳性产物位于细胞核外的膜性结构上，在铀-铅双染组显示很高的电子密度，但是背景染色也很深，在铀单染组的反差比较好，而未染色组的反差更好。结论免疫电镜技术中针对不同的免疫阳性反应选用不同的电子染色方法，有利于阳

2、性结果的判断与鉴别。【关键词】免疫电镜技术；雌激素受体；海马；电子染色　　Abstract:ObjectiveToexploredifferentimmunoelectronicstainingmethodsontheultralocalizationofimmunohistochemistry.MethodsThenovelmembranereceptorGPR30immunohistochemistry,dioxydateuranium-onlyornoelectrostaining)icroscope,GPR30shomunoreactivityintheh

3、ippocampalpyramidalneurons.Underelectronicmicroscope,theblankstaining(noelectrostaining)sectionsshomunoreactiveintensity,differentelectronicstainingmunoelectronicmicroscope;estrogenreceptor;hippocampus;electronicstaining　　免疫电镜标记技术已广泛应用于生物学的各个方面［1-2］，它能在超微结构水平上精确、细致地定位，特异性高，方法简便，优越性十分显

4、著。而如何能成功确定免疫反应阳性区域并选取合适的区域是免疫电镜成败的关键。为此我们应用免疫电镜技术但选用不同的电子染色方式，以比较几种电子染色的优缺点，从而为免疫电镜技术的开展提供一些参考。　　1材料与方法　　1.1动物及分组　　成年雌性SD大鼠共12只，体重（210±10）g，由第三军医大学实验动物中心提供。随机分为实验组（加抗体组）和空白对照组（不加抗体的阴性对照），实验组又分双氧铀-柠檬酸铅双染色、双氧铀单染与未染色三组进行对比观察。　　1.2主要试剂和药品　　羊抗兔GPR30（ab12563）多克隆抗体购自英国Abcam公司，抗体稀释液（antibodyd

5、iluentation公司，封闭血清、DAB显色试剂盒等购自北京中杉公司，其余试剂均为市售分析纯。　　1.3仪器设备　　TEAI-10型透射电子显微镜（PHILIPS公司），超薄切片机（LKB公司）。　　1.4免疫组织化学染色　　1.4.1动物固定、取材动物用5%水合氯醛麻醉，开胸，经左心室插管到主动脉，剪开右心耳，先后灌注生理盐水200mL和4%多聚甲醛溶液300mL。灌注后取出大脑组织，分离海马放入2.5%戊二醛溶液。然后用振荡切片机制备海马切片（片厚100μm），切片入2.5%戊二醛溶液后固定2h，用0.01mol/LPBSpH为7.2～7.4洗涤3次，每次

6、1h，最后保存于4℃备用。　　1.4.2包埋前免疫电镜步骤按　　3讨论　　免疫电镜在形态学研究中具有很广泛的应用，然而其染色程度却很难控制，一般不容易得到理想的染色结果。免疫电镜的标记方法比较多，常用的标记方法有胶体金标记以及酶标法。胶体金标记的方法由于其颗粒大小一致，在电镜下显示清楚，所以有广泛的应用。但是，由于胶体金在光镜下看不见而无法准确定位，免疫组化是否成功、组织的阳性区域在什么位置无法明确，因而胶体金标记的方法在一定程度上带有一定的“盲目性”，最终使得免疫电镜的工作量非常大而很难得到理想的结果。　　相比之下，酶标电镜免疫组化就直观很多，大大简化了免疫电镜

7、的工作量。在酶标电镜免疫组化技术中，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来，最常用的显色剂为DAB（其显示结果为棕黄色）。DAB是广泛应用的电子供体之一，较敏感且终产物具有嗜锇性，经锇酸处理，电子密度增加，适于在电镜下确定抗原的存在部位［5］。尽管DAB标记法存在阳性颗粒大小不均一，导致在电镜下显示效果不如胶体金的不足，但是通过DAB呈色反应，在光镜下可以清楚地确定组织切片中阳性细胞的位置，从而为成功进行电镜下观察奠定了很好的基础。这是胶体金标记方法无法比拟的。　　为了增强电子密度，一般都会在锇酸处理

8、后用铀-铅