免疫电镜细胞化学技术.ppt

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1、免疫电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与功能的相互关系。免疫电镜技术免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，根据抗原抗体的高度特异性结合原理，用高电子密度的标记物（如：金、铁蛋白等）在超微结构水平上检测某些抗原性物质的定位、定性、半定量的一种方法。目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术，免疫铁蛋白技术和免

2、疫胶体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗铁蛋白电镜复合物技术。用以标记抗体的酶要具备以下条件：1.与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。2.酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。3.在体液或组织中不存在该酶的底物。酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP）电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则1、取材与固定取材原则与常规电镜取材相同，力求保持组织新鲜，标本固定要求是既要保持组织成分的抗原性，又要保存细胞的超微结构。低浓度的甲醛短时固定队抗原性保存好，但是超微结构保存又受影响。（1）2%多聚甲醛液（2）2%多聚甲醛

3、-0.01%～0.05%戊二醛（3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛2．通过冰冻切片或震动切片获得厚切片。冰冻切片8µm，震动切片20～80µm。3．漂洗后的厚切片可按免疫组化步骤进行标记染色。4．DAB显色后再进行锇酸后固定以及电镜包埋切片处理。5.如果确定待测抗原的抗原性不会由于脱水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色。三、免疫染色包埋前染色：是指在未经包埋的预切厚片上先进行免疫染色，然后再进行脱水包埋超薄切片。优点：（1）切片染色前未经四氧化锇固定、脱水、包埋等处理，对抗原性破坏较小。（2）可在定位后再进行超薄切片，提高阳性检出率.（3）免疫染色后，用

4、四氧化锇后固定，有利于膜型结构的保存。包埋后染色：是指在超薄切片上进行免疫染色。优点：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫试剂分子穿透障碍，不需要穿透剂。2.免疫染色①直接法：用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，尔后进行酶与底物反应，终产物沉淀在抗原抗体反应部位。②间接法：依次使用两种不同抗体，先使用未标记的特异性抗体即第一抗体，后者与标本中的抗原反应。然后使用过氧化物酶标记第二抗体，最后酶与底物反应，生产沉淀。结果判定在已知阳性、阴性样品成立的前提下，出现高电子密度的颗粒，即指示抗原抗体的存在。（二）胶体金免疫电镜技术利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，使其与抗体相互吸引

5、从而将抗体标记。再以金标记的抗体与待检抗原相互结合，由于金颗粒的电子密度高，电镜观察到金颗粒的位置，即抗原所在。2、胶体金的特性①颜色：胶体金的颜色与金粒子的直径有关，5-60nm时为红色，95nm是为蓝色，用于免疫细胞化学的胶体金呈红葡萄酒色。②影响胶体金稳定的因素：a.电解质：少量有促进稳定的作用，过量则破坏。b.胶体金的浓度：浓度越高容易导致胶体金凝集。c.温度：长时间加热可使稳定性有所下降。檬酸三钠的用量与胶体金直径的关系0.01%氯化金1%柠檬酸三钠胶体金颗粒直径（ml)（ml）（nm）1003.019.01004.015.01006.012.51001.524.51

6、001.041.01000.671.5（1）胶体金的制备①柠檬酸三钠还原法（15nm）②鞣酸-柠檬酸钠还原法（6nm）鞣酸-柠檬酸钠还原法制备不同大小胶体金颗粒的配方1%柠檬酸三钠1%鞣酸0.025mol/LK2CO3去离子双蒸水胶体金颗粒直径（ml)（ml）（ml）（ml）（nm）40.02019.981540.1019.901040.50.515.006.043314.003.5优点：①胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显的变化。②金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒清晰可辨，易精确定位。③不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于扫描电镜对细

7、胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。④胶体金标记物易于制备，而且可以根据需要制备不同大小的胶体金，因此可以进行免疫电镜的双重标记。⑤根据抗原抗体反应部分结合金颗粒数量的多少，可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。（2）电镜包埋前免疫金染色①新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定0.5～1h），制成厚切片。②0.05mol/LTBSpH7.4漂洗3次，每次15min。③0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。④TBS漂洗，5min×3次，⑤1%牛血清孵育组织块30min。