免疫电镜技术（immunoelectron microscopy,iem）又称为免

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1、免疫电镜技术（immunoelectronmicroscopy，IEM）又称为免疫细胞化学技术，是在免疫组织化学技术（immunohistochemistry）的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。   铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很

2、强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。   酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经OsO4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。   胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。胶体金主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变

3、，可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1～150nm）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。此外，胶体金还能用于冷冻蚀刻标本的 免疫标记。    抗体的制备，标本的处理，免疫标记，对照实验、结果的观察和解析。   抗体的制备   特异性高、亲

4、和力强的高效价抗体是获得理想的免疫标记结果的首要条件要。抗体可购买或自己制备。大分子完全抗原，可直接免疫动物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠来获得抗体。半抗原，用偶联剂使半抗原与大分子物质结合成复合物，再去免疫动物产生抗体，大分子物质称为载体蛋白，以甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为常用。偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等。目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为理想。   标本的处理   为了既能将抗原准确定位甚至定量，又能观察到近似于生活状态下的细胞超微结构，必须选择合适的固定剂，慎重处理样品。   取材   单细胞：培养细胞或血细胞应随用随取。悬浮培养细胞可先离心（800rpm，5min），用

5、磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗1次后进行固定。贴壁细胞则可先将其培养在玻片上，用PBS轻轻冲洗后立即固定，也可用胰酶将细胞消化下来，按悬浮培养细胞的制备方法制备。组织：取组织块时做到越快越好，最好在没有停止血流前就取材。若观察的对象为肺、大脑、脊髓或内分泌器官等比较柔软的组织，应先做灌注固定，再用锐利的刀片将其切成约2mm×2mm×lmm大小的组织块，切时要避免挤压与牵拉，然后投入到固定液中继续固定。   固定   固定剂常会对抗原的活性产生不同程度影响，为了保存细胞的超微结构和抗原的活性，应通过预试验，确定固定剂的种类、浓度、温度、pH及固定时间和方式，可用已知效价的抗原进行试验，选择合适的

6、固定方法。   常用的免疫电镜标本固定液   多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PG）：1％多聚甲醛对组织细胞的抗原性影响不大，若加入超过0.1％戊二醛，抗原性就会迅速减弱；当戊二醛的浓度低到0.01％～0.05％时，对抗原性的影响便不显著，而细胞超微结构的保存也可获得很大改善。所以推荐用1％多聚甲醛加0.01％～0.05％戊二醛作为免疫电镜标本的固定剂，固定时间为4～5h。对有些抗原性较强的标本，也可采用4％多聚甲醛加0.05％～0.5％戊二醛进行固定。某些抗原对戊二醛极其敏感，固定液只能用2～4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。不充分的固定会造成抗原提取或移位，同时醛类等交联固定剂会改变蛋白质分子

7、的结构而影响其抗原性，所以在不明显影响抗原性的前提下，选择合适的固定浓度和时间，尽可能强一些为好。这里我们特别推荐使用美国EMS公司的多聚甲醛溶液和戊二醛溶液，常用货号为157-8和16220。   过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液（简称PLP）：PLP液含0.01mol/L过碘酸钠、0.075mol/L赖氨酸、2％多聚甲醛及0.037mol/L磷酸缓冲液。其机制是借助过碘酸盐氧化抗原，一般为糖蛋白的糖类部分，使其羟