免疫电镜技术运用过程中电子染色方法的选用

《免疫电镜技术运用过程中电子染色方法的选用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、免疫电镜技术运用过程中电子染色方法的选用作者：赵承军，张东梅，邓其跃，陈鹏慧，蔡文琴，陶忠芬，张吉强【摘要】目的探究免疫电镜不同染色方法对免疫组化阳性实验结果影响的关系。方法组织切片经常规免疫组化（雌激素受体GPR30）并行DAB-硫酸镍铵显色后进行电镜切片，然后分为双氧铀-柠檬酸铅双染、双氧铀单染与未染色3组，以便对不同电子染色结果进行比较。结果GPR30免疫阳性产物位于细胞核外的膜性结构上，在铀-铅双染组显示很高的电子密度，但是背景染色也很深，在铀单染组的反差比较好，而未染色组的反差更好。结论免疫电镜技术中针对不同

2、的免疫阳性反应选用不同的电子染色方法，有利于阳性结果的判断与鉴别。【关键词】免疫电镜技术；雌激素受体；海马；电子染色　　Abstract:ObjectiveToexploredifferentimmunoelectronicstainingmethodsontheultralocalizationofimmunohistochemistry.MethodsThenovelmembranereceptorGPR30immunohistochemistrywithDAB-nickelintensificationwasap

3、plied,thenultrathinsectionswerepreparedanddifferent8eletronicstaining(citricleadplusdioxydateuranium,dioxydateuranium-onlyornoelectrostaining)wascarriedout.ResultsUnderlightmicroscope,GPR30showedverystrongimmunoreactivityinthehippocampalpyramidalneurons.Underele

4、ctronicmicroscope,theblankstaining(noelectrostaining)sectionsshowedthehighestcontrast,whilethedoublestainingsectionsshowedthelowestcontrast.ConclusionFordifferentimmunoreactiveintensity,differentelectronicstainingwassuggested.　　Keywords:immunoelectronicmicroscop

5、e;estrogenreceptor;hippocampus;electronicstaining　　免疫电镜标记技术已广泛应用于生物学的各个方面［1-2］，它能在超微结构水平上精确、细致地定位，特异性高，方法简便，优越性十分显著。而如何能成功确定免疫反应阳性区域并选取合适的区域是免疫电镜成败的关键。为此我们应用免疫电镜技术但选用不同的电子染色方式，以比较几种电子染色的优缺点，从而为免疫电镜技术的开展提供一些参考。　　1材料与方法8　　1.1动物及分组　　成年雌性SD大鼠共12只，体重（210±10）g，由第三军医大学

6、实验动物中心提供。随机分为实验组（加抗体组）和空白对照组（不加抗体的阴性对照），实验组又分双氧铀-柠檬酸铅双染色、双氧铀单染与未染色三组进行对比观察。　　1.2主要试剂和药品　　羊抗兔GPR30（ab12563）多克隆抗体购自英国Abcam公司，抗体稀释液（antibodydiluentwithbackground-reducing,S302281）与羊抗兔EnVisionTM试剂盒（GK400305）购自Dakocytomation公司，封闭血清、DAB显色试剂盒等购自北京中杉公司，其余试剂均为市售分析纯。　　1.3

7、仪器设备　　TECNAI-10型透射电子显微镜（PHILIPS公司），超薄切片机（LKB公司）。　　1.4免疫组织化学染色8　　1.4.1动物固定、取材动物用5%水合氯醛麻醉，开胸，经左心室插管到主动脉，剪开右心耳，先后灌注生理盐水200mL和4%多聚甲醛溶液300mL。灌注后取出大脑组织，分离海马放入2.5%戊二醛溶液。然后用振荡切片机制备海马切片（片厚100μm），切片入2.5%戊二醛溶液后固定2h，用0.01mol/LPBSpH为7.2～7.4洗涤3次，每次1h，最后保存于4℃备用。　　1.4.2包埋前免疫电镜步

8、骤按文献［3-4］进行。简述如下：3%H2O2封闭15min，0.01mol/LPBS漂洗后，用正常山羊血清封闭30min，然后加入一抗（GPR30，1∶200）于4℃孵育过夜。PBS漂洗后加入羊抗兔EnVisionTM试剂，室温1h，0.01mol/LPBS漂洗后用硫酸镍铵-DAB显色5min。在解剖显微镜下选取免疫阳性反应区域