角膜缘干细胞体外培养的研究进展

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1、角膜缘干细胞体外培养的研究进展【关键词】角膜缘；干细胞；体外培养；眼损伤　　角膜上皮细胞具有自我更新的能力，眼表的正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成。随着眼表疾病研究有突破性进展，角膜缘干细胞在眼表中的重要性越来越受到人们的重视，角膜缘干细胞体外培养的研究也日渐增多。笔者现就角膜缘干细胞的体外培养与临床应用作一综述。　　1概述　　　　角膜缘干细胞是角膜上皮增殖、分化、移行的源泉。角膜缘干细胞具有其他干细胞所具有的特殊的生物学特性，并通过向心性移动和角膜上皮基底细胞的分裂、迁移，来补充角膜表面脱落的上皮细胞，完成上

2、皮细胞的更新这一动态的平衡过程。目前认为角膜缘Vogt栅栏内的网状嵴上皮是角膜上皮干细胞的位置所在。1971年Davanger等［1］提出角膜缘Vogt栅栏的概念并观察到此处细胞向角膜中心水平移动。1986年Schermer等［2］利用特异性64KD角蛋白（K3）的手段，正确定位角膜缘上皮干细胞的存在。1987年Ebato等［3］通过比较角膜不同部位细胞在体外培养的生长情况，也进一步证实角膜上皮干细胞位于角膜缘处。　　　　角膜缘干细胞的确定和经过不断的探索研究，发现角膜缘干细胞具有以下特点［4］：①位于角膜缘基底部，占整个角膜上皮细胞的0.5%

3、～10%；②具有水平向心运动和垂直向上运动；③增殖力高，细胞周期长，分化程度低，不对称分裂；④不表达角蛋白K3；⑤含有丰富的蛋白酶：α-烯醇酶、细胞色素氧化酶、碳酸酐酶等；⑥角膜缘上皮细胞正常处于G1晚期，细胞富含周期蛋白A、D、E和增殖细胞核心抗原。　　2角膜缘干细胞的获取和分离角膜缘干细胞的正确定位，使获得干细胞作体外培养成为可能。　　2.1取材　　动物取材在全身麻醉下进行，用1/1000络合碘消毒眼周，冲洗眼球后用手术刀从角膜缘切取组织块。尸体取材时，在死亡后6h内取下眼球，剪取角膜缘内外各1mm角膜缘组织，去除多余结膜组织和基质层。用含

4、双抗（105u/L青霉素加100mg/L链霉素）Hank液漂洗备用。　　2.2角膜缘干细胞的分离和培养　　常用的分离方法有组织块直接培养、消化法及两种方法同时应用的混合法。　　2.2.1组织块培养法　　将上述组织块剪成1mm×1mm×1mm大小，放入含少量纯胎牛血清培养瓶中密闭2h，缓慢加入少量培养基，37℃，5%CO2，95%湿度孵化箱过夜，次日补加培养基。接种后3天首次换液，以后隔日换液，每日倒置显微镜观察。此法操作环节少，细胞损伤小，可减少污染机会。但培养时间长，细胞成分复杂，常混有纤维细胞，分离和纯化较困难。　　2.2.2酶消化法　　将

5、组织块剪成2mm×2mm大小，Hank液冲洗2次，1.25g/L胰蛋白酶与0.2g/LEDTA1∶1混合为消化液，用量为组织量的30～50倍，消化10～15min到组织块疏松，弃去消化液。Hank液冲洗2次，消除EDTA消化作用，加入等量200ml/L胎牛血清的细胞培养液终止胰蛋白酶消化。吸出培养液后再加入新的培养液2次，消除残余消化作用。然后加入培养液进行吹打使细胞分散，1000r/，离心5min，取重悬细胞以100×106/L接种量移入有孔培养板进行培养。此法可在较短时间内获得细胞进行培养和研究，但操作复杂，对消化时间和温度的控制有较高的要

6、求。　　2.2.3混合法　　即上述两种方法同时使用。组织块消化后所得的细胞悬液移入培养器进行培养的同时，将组织块也一起移入同时培养。此法培养的细胞易存活，形成膜片时间短，获得的细胞中含有少量纤维细胞，既能增加上皮膜片的张力强度，又能起到“饲细胞”的作用，促进细胞生长，有利于细胞成膜生长进行移植研究。　　3培养基的选择　　　　角膜缘干细胞在体外培养时具有极高的增殖潜力。由于各人采用的培养基不同，增殖力亦有所不同。目前用于角膜缘干细胞的基础培养液主要有DMEM、DMEM/F12（1∶1）、M199、M199/F12（1∶1）、PRMI-1640等。

7、目前大多采用DMEM/F12（1∶1）及添加激素的上皮细胞培养液(SHEM)做基本培养基，加入10%小牛血清，0.3mg/ml谷氨酸胺，0.1u/ml胰岛素，0.5μg/ml氢化可的松，10ng/ml表皮生长因子，0.18mmol/L腺嘌呤，0.1mg/L霍乱毒素等。但何种培养基最适于培养角膜缘干细胞，目前尚无报道。　　　　血清成分复杂，含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响某些功能的表达，对角膜上皮细胞的生长具有抑制作用，含血清培养基仅能促进角膜缘干细胞的增殖，故只适宜于角膜缘干细胞的培养与分离。将角膜缘干细胞培养为上皮细

8、胞并用于临床治疗眼表疾病，多采用无血清培养基。目前用于角膜上皮细胞培养的无血清培养基有MCDB153，EpilifeTM，无钙高糖的DMEM等，并添加