山莨菪碱治疗兔创伤性急性肺损伤分子生物学机制的实验研究

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1、山莨菪碱治疗兔创伤性急性肺损伤分子生物学机制的实验研究作者：简文，樊爱琳，尹文，戚好文，柏长青【摘要】目的：探讨山莨菪碱（6542）对家兔创伤性急性肺损伤（ALI）治疗作用的分子生物学机制.方法：采用创伤性急性肺损伤模型，将家兔随机分为对照组（CG），肺损伤组（IG）和治疗组（EG），每组24只.各组动物分别于肺损伤模型建立后1,2,3,4h各放血处死6只，留取支气管肺泡灌洗液（BALF），分离肺泡巨噬细胞（PAM），用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）和RTPCR法检测PAM中NFκB的活性变化及TNFαmRNA的表达水平，用ELISA法

2、检测BALF上清中TNFα和IL8的含量.结果：IGNFκB活性、TNFαmRNA表达及TNFα,IL8含量于模型建立后1~4h内均明显高于CG（P<0.01）；EG经山莨菪碱治疗后上述指标与IG相比均有明显下降（P<0.01,P<0.05）.结论：山莨菪碱对ALI有治疗作用，此作用与其对NFκB活性及TNFαmRNA,TNFα,IL8表达抑制有关.【关键词】山莨菪碱；创伤；急性肺损伤；核因子κB；细胞因子0引言TNFα等细胞因子的释放及其介导的炎症反应在急性肺损伤（acutelunginjury,ALI）的

3、发生、发展中起重要作用［1］.NFκB是一种基因转录调节蛋白，通过调控TNFα和白细胞介素等细胞因子的转录，在炎症、免疫、急性期反应中发挥重要作用［2］.山莨菪碱是一种植物药，在休克、全身炎症反应综合征的治疗中，显示出一定的保护作用［3］.此类药物在AIL的防治中也有一定的价值，但作用机制尚不明了［4］.我们采用分子生物学技术对山莨菪碱治疗创伤性ALI时NFκB活化、TNFαmRNA表达及BALF中TNFα,IL8的释放进行研究，探索其治疗创伤性ALI的可能机制.1材料和方法1.1材料健康成年家兔，雌雄不拘，体质量2.0～2.5kg，由本

4、校动物实验中心提供.Lipopolysaccharide（O111:B4，LPS，Sigma）；NEPERTM试剂盒（Pierce）；GelShiftAssay试剂盒（Promega）；γ32PATP（北京亚辉生物医学工程公司）；TrizolReagent（Gibco）；RNAPCR试剂盒（大连Takara）；ELISA试剂盒购自本校基础部免疫学教研室.1.2方法健康成年家兔72只，随机分为正常对照（Controlgroup，CG）、创伤性急性肺损伤（Injurygroup，IG）和山莨菪碱治疗（Experimentalgroup，EG）3组，每

5、组24只.IG,EG动物LPS注射联合撞击，建立创伤性急性肺损伤模型，CG不做胸壁撞击，静注等量生理盐水代替内毒素.EG动物于模型建立后立即予以山莨菪碱2mg/kgiv，随后以1mg(kg/h)维持，CG和IG分别予以等量生理盐水，剂量与方法同EG.各组分别于模型建立后1,2,3,4h由颈动脉插管放血处死6只动物.立即行气管插管，用生理盐水分两次行支气管肺泡灌洗（bronchoalveolarlavagefluid，BALF），5mL/次，共10mL，回收率70％左右.将BALF1000r/min离心10min，沉淀用PBS液洗涤后用RPMI1640

6、培养液悬浮，置于25mL培养瓶中，37℃，50mL/LCO2孵箱中培养1h，收集贴壁细胞，计数、瑞氏染色证实为巨噬细胞，纯度>95%，台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力>90%.1.2.1NFκB活性的检测用NEPERTMNuclearandCytoplasmicExtractionReagents提取PAM核蛋白，-70℃保存，Bradford法测定蛋白浓度；用γ32PATP标记NFκB寡核苷酸探针(由GelShiftAssay试剂盒提供)（5′AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3′,3′TCAACTCCCCTGAAAG

7、GGTCCG5′），采用乙醇纯化法纯化，并用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）测定NFκB的活性，用凝胶图像分析系统对放射自显影胶片进行扫描，以各样品与标准品电泳滞后带的光密度比值来表示NFκB的活性，同时进行特异性及非特异性竞争试验.1.2.2TNFαmRNA表达用TrizolReagent试剂盒提取PAM总RNA，采用RTPCR法检测各时间点PAM中TNFαmRNA水平，参照2.1兔PAM中NFκB的活性CG动物NFκB活性在实验期间稳定在0.2以内.IG于模型建立后1～4h内NFκB活性均明显高于CG（P<0.01），

8、在2h达到高峰，是同期CG的8倍.EG经山莨菪碱治疗后，NFκB活性虽然高于CG组，但明显低于IG（P&l