欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:9538576
大小:52.50 KB
页数:4页
时间:2018-05-03
《山莨菪碱治疗兔创伤性急性肺损伤分子生物学机制的实验研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、山莨菪碱治疗兔创伤性急性肺损伤分子生物学机制的实验研究作者:简文,樊爱琳,尹文,戚好文,柏长青【摘要】目的:探讨山莨菪碱(6542)对家兔创伤性急性肺损伤(ALI)治疗作用的分子生物学机制.方法:采用创伤性急性肺损伤模型,将家兔随机分为对照组(CG),肺损伤组(IG)和治疗组(EG),每组24只.各组动物分别于肺损伤模型建立后1,2,3,4h各放血处死6只,留取支气管肺泡灌洗液(BALF),分离肺泡巨噬细胞(PAM),用凝胶电泳迁移率改变分析法(EMSA)和RTPCR法检测PAM中NFκB的活性变化及TNFαmRNA的表达水平,用ELISA法
2、检测BALF上清中TNFα和IL8的含量.结果:IGNFκB活性、TNFαmRNA表达及TNFα,IL8含量于模型建立后1~4h内均明显高于CG(P<0.01);EG经山莨菪碱治疗后上述指标与IG相比均有明显下降(P<0.01,P<0.05).结论:山莨菪碱对ALI有治疗作用,此作用与其对NFκB活性及TNFαmRNA,TNFα,IL8表达抑制有关.【关键词】山莨菪碱;创伤;急性肺损伤;核因子κB;细胞因子0引言TNFα等细胞因子的释放及其介导的炎症反应在急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)的
3、发生、发展中起重要作用[1].NFκB是一种基因转录调节蛋白,通过调控TNFα和白细胞介素等细胞因子的转录,在炎症、免疫、急性期反应中发挥重要作用[2].山莨菪碱是一种植物药,在休克、全身炎症反应综合征的治疗中,显示出一定的保护作用[3].此类药物在AIL的防治中也有一定的价值,但作用机制尚不明了[4].我们采用分子生物学技术对山莨菪碱治疗创伤性ALI时NFκB活化、TNFαmRNA表达及BALF中TNFα,IL8的释放进行研究,探索其治疗创伤性ALI的可能机制.1材料和方法1.1材料健康成年家兔,雌雄不拘,体质量2.0~2.5kg,由本
4、校动物实验中心提供.Lipopolysaccharide(O111:B4,LPS,Sigma);NEPERTM试剂盒(Pierce);GelShiftAssay试剂盒(Promega);γ32PATP(北京亚辉生物医学工程公司);TrizolReagent(Gibco);RNAPCR试剂盒(大连Takara);ELISA试剂盒购自本校基础部免疫学教研室.1.2方法健康成年家兔72只,随机分为正常对照(Controlgroup,CG)、创伤性急性肺损伤(Injurygroup,IG)和山莨菪碱治疗(Experimentalgroup,EG)3组,每
5、组24只.IG,EG动物LPS注射联合撞击,建立创伤性急性肺损伤模型,CG不做胸壁撞击,静注等量生理盐水代替内毒素.EG动物于模型建立后立即予以山莨菪碱2mg/kgiv,随后以1mg(kg/h)维持,CG和IG分别予以等量生理盐水,剂量与方法同EG.各组分别于模型建立后1,2,3,4h由颈动脉插管放血处死6只动物.立即行气管插管,用生理盐水分两次行支气管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavagefluid,BALF),5mL/次,共10mL,回收率70%左右.将BALF1000r/min离心10min,沉淀用PBS液洗涤后用RPMI1640
6、培养液悬浮,置于25mL培养瓶中,37℃,50mL/LCO2孵箱中培养1h,收集贴壁细胞,计数、瑞氏染色证实为巨噬细胞,纯度>95%,台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力>90%.1.2.1NFκB活性的检测用NEPERTMNuclearandCytoplasmicExtractionReagents提取PAM核蛋白,-70℃保存,Bradford法测定蛋白浓度;用γ32PATP标记NFκB寡核苷酸探针(由GelShiftAssay试剂盒提供)(5′AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3′,3′TCAACTCCCCTGAAAG
7、GGTCCG5′),采用乙醇纯化法纯化,并用凝胶电泳迁移率改变分析法(EMSA)测定NFκB的活性,用凝胶图像分析系统对放射自显影胶片进行扫描,以各样品与标准品电泳滞后带的光密度比值来表示NFκB的活性,同时进行特异性及非特异性竞争试验.1.2.2TNFαmRNA表达用TrizolReagent试剂盒提取PAM总RNA,采用RTPCR法检测各时间点PAM中TNFαmRNA水平,参照2.1兔PAM中NFκB的活性CG动物NFκB活性在实验期间稳定在0.2以内.IG于模型建立后1~4h内NFκB活性均明显高于CG(P<0.01),
8、在2h达到高峰,是同期CG的8倍.EG经山莨菪碱治疗后,NFκB活性虽然高于CG组,但明显低于IG(P&l
此文档下载收益归作者所有