山莨菪碱治疗兔创伤性急性肺损伤分子生物学机制的实验研究论文

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1、山莨菪碱治疗兔创伤性急性肺损伤分子生物学机制的实验研究论文简文，樊爱琳，尹文，戚好文，柏长青【摘要】目的：探讨山莨菪碱（6542）对家兔创伤性急性肺损伤（ALI）治疗作用的分子生物学机制.方法：采用创伤性急性肺损伤模型，将家兔随机分为对照组（CG），肺损伤组（IG）和治疗组（EG），每组24只.各组动物分别于肺损伤模型建立后1,2,3,4h各放血处死6只.freelRNA的表达水平，用ELISA法检测BALF上清中TNFα和IL8的含量.结果：IGNFκB活性、TNFαmRNA表达及TNFα,IL8含量于模型建立后1~4h内均明显高于CG（P0.01）；EG经山莨菪碱

2、治疗后上述指标与IG相比均有明显下降（P0.01,P0.05）.结论：山莨菪碱对ALI有治疗作用，此作用与其对NFκB活性及TNFαmRNA,TNFα,IL8表达抑制有关.【关键词】山莨菪碱；创伤；急性肺损伤；核因子κB；细胞因子0引言TNFα等细胞因子的释放及其介导的炎症反应在急性肺损伤（acutelunginjury,ALI）的发生、发展中起重要作用［1］.NFκB是一种基因转录调节蛋白，通过调控TNFα和白细胞介素等细胞因子的转录，在炎症、免疫、急性期反应中发挥重要作用［2］.山莨菪碱是一种植物药，在休克、全身炎症反应综合征的治疗中，显示出一定的保护作用［3］

3、.此类药物在AIL的防治中也有一定的价值，但作用机制尚不明了［4］.我们采用分子生物学技术对山莨菪碱治疗创伤性ALI时NFκB活化、TNFαmRNA表达及BALF中TNFα,IL8的释放进行研究，探索其治疗创伤性ALI的可能机制.1材料和方法1.1材料健康成年家兔，雌雄不拘，体质量2.0～2.5kg，由本校动物实验中心提供.Lipopolysaccharide（O111:B4，LPS，Sigma）；NEPERTM试剂盒（Pierce）；GelShiftAssay试剂盒（Promega）；γ32PATP（北京亚辉生物医学工程公司）；TrizolReagent（Gibco）

4、；RNAPCR试剂盒（大连Takara）；ELISA试剂盒购自本校基础部免疫学教研室.1.2方法健康成年家兔72只，随机分为正常对照（Controlgroup，CG）、创伤性急性肺损伤（Injurygroup，IG）和山莨菪碱治疗（Experimentalgroup，EG）3组，每组24只.IG,EG动物LPS注射联合撞击，建立创伤性急性肺损伤模型，CG不做胸壁撞击，静注等量生理盐水代替内毒素.EG动物于模型建立后立即予以山莨菪碱2mg/kgiv，随后以1mg(kg/h)维持，CG和IG分别予以等量生理盐水，剂量与方法同EG.各组分别于模型建立后1,2,3,.freelL/次，共1

5、0mL，回收率70％左右.将BALF1000r/min离心10min，沉淀用PBS液洗涤后用RPMI1640培养液悬浮，置于25mL培养瓶中，37℃，50mL/LCO2孵箱中培养1h，收集贴壁细胞，计数、瑞氏染色证实为巨噬细胞，纯度95%，台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力90%.1.2.1NFκB活性的检测用NEPERTMNuclearandCytoplasmicExtractionReagents提取PAM核蛋白，-70℃保存，Bradford法测定蛋白浓度；用γ32PATP标记NFκB寡核苷酸探针(由GelShiftAssay试剂盒提供)（5′AGTTGAGGGGACTTT

6、CCCAGGC3′,3′TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5′），采用乙醇纯化法纯化，并用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）测定NFκB的活性，用凝胶图像分析系统对放射自显影胶片进行扫描，以各样品与标准品电泳滞后带的光密度比值来表示NFκB的活性，同时进行特异性及非特异性竞争试验.1.2.2TNFαmRNA表达用TrizolReagent试剂盒提取PAM总RNA，采用RTPCR法检测各时间点PAM中TNFαmRNA水平，参照文献方法设计特异引物：TNFα1：5′GCTCACGGACAACCAGCT3′，TNFα2:5′TCCCAAAGTAG

7、ACCTGCCC3′，扩增产物332bp，选用βactin作内参对照，与TNFαcDNA一同扩增.扩增产物行20g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以TNFα和βactin扩增产物（177bp）的光密度比值来反应各组样品TNFαmRNA的表达水平.1.2.3BALF中TNFα和IL8含量的检测采用本校免疫学教研室的ELISAKit进行检测，具体操作按说明书进行.统计学处理：各组实验数据以x±s表示，方差分析比较3组动物各采样点有关指标的差异.采