葛根素抑制葡萄糖腹膜透析液中糖基化终末产物形成的体外研究

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1、葛根素抑制葡萄糖腹膜透析液中糖基化终末产物形成的体外研究：张苗，蒋春明，孙琤，龚立峰【摘要】目的：观察葛根素能否在体外减少葡萄糖腹膜透析液中晚期糖基化终末产物(AGEs)的产生。方法：将20g牛血清白蛋白充分溶解于1000ml2.5%腹膜透析液中，根据葛根素终浓度分5组观察(葛根素终浓度A组为0g·L-1，B组为0.01g·L-1，C组为0.05g·L-1，D组为0.1　g·L-1，E组为0.2g·L-1)。过滤除菌后37℃保存，分别于第1天、7天、1个月、2个月以及3个月时取样本1ml进行AGEs测定。结果：腹膜透析液中添加牛血清白蛋白后，随着

2、时间的延长，透析液中AGEs的浓度逐渐升高。加入不同浓度葛根素的试验组，其AGEs的浓度均较同期未加入葛根素的试验组明显降低，并且随着葛根素浓度增加，AGEs的浓度渐降。结论：葛根素对体外腹膜透析液中AGEs形成有明显的抑制作用，且它的这种抑制作用呈现剂量依赖性。【关键词】葛根素;腹膜透析;晚期糖基化终末产物葡萄糖腹膜透析液(peritonealdialysissolution,PDS)的生物不相容性已被人们所公认，其是导致腹膜纤维化、腹膜透析功能丧失的主要原因。近年的研究表明，葡萄糖PDS可导致大量晚期糖基化终末产物(advancedglyco

3、sylationendproducts,AGEs)的形成，继而AGEs在腹膜纤维化的发生发展中发挥显著作用[1]。近年来，许多实验研究证明，中药葛根素(Puerarin)具有抑制蛋白质非酶糖基化作用，从而减少AGEs形成[2]。本研究探讨了葛根素是否具有抑制葡萄糖PDS产生AGEs的作用，报道如下。　　1材料与方法　　1.1试剂与仪器　　2.5%BaxterPDS为广州百特医疗用品公司产品;葛根素注射液为浙江康恩贝制药股份有限公司产品，规格为100mg·支-1;牛血清白蛋白购自GIBCO公司、蛋白酶K购自Merck公司;AGEBSA标准品(10

4、mg·ml-1)购自Biovision公司;1050型高效液相色谱仪和1046型荧光检测器为美国Hel·min-1，设定荧光检测器激发波长247　nm，发射波长440　nm，每份样本进样2次，2条荧光曲线峰高的平均值用于计算结果。　　称取40mg蛋白酶K，用25mlPBS液配置成1.6mg·ml-1蛋白酶K溶液，吸取AGEBSA标准品溶液270μl和蛋白酶K溶液30μl混匀，37℃孵育24h，得到9mg·ml-1标准AGEP溶液，用PBS液稀释成不同浓度(0.1、0.5、1、5、10、50μg·ml-1)AGEP溶液，同时吸取蛋白酶K溶液2

5、0μl作为空白对照，采用流动注射分析法检测。根据荧光曲线的峰高绘制标准曲线，拟合方程，通过方程计算出样本AGEP含量(U·ml-1)，1U·ml-1AGEP相当于1μg·ml-1AGEBSA水解所得的AGEP量。最终结果用μg·ml-1表示。　　1.3实验分组　　将20g牛血清白蛋白充分溶解于2.5%PDS1000ml，根据葛根素终浓度分为A、B、C、D、E5组观察，每组重复6份样本，每份标本样本含量10ml。其中A组葛根素终浓度为0g·L-1，B组为0.01g·L-1，C组为0.05g·L-1,D组为0.1g·L-1，E组为0.2g·L

6、-1。过滤除菌后37℃温箱保存，分别于第1天、7天、1个月、2个月以及3个月时取样本1ml进行AGEs测定。　　1.4统计学处理　　对实验结果中计量数据用x±s表示，组间比较采用方差分析法。　　2结果　　PDS添加牛血清白蛋白后，随着时间的延长，各组透析液中AGEs浓度逐渐增高，见表1。其中A组增加最多，在第1天为(10.5040±2.64663)μg·ml-1,至第3个月，AGEs浓度就高达(171.2078±38.02560)μg·ml-1。　　随着添加葛根素的浓度不同，AGEs随时间增加的量也不同。在同一时间点随葛根素浓度升高，AGEs的浓

7、度逐渐降低，见表1和图1。表1各组AGEs浓度变化与A组比较，1)P<0.05，2)P<0.01图1葛根素对PDSAGEs形成的抑制作用　　3讨论　　早期研究显示，尿毒症患者应用葡萄糖PDS进行透析，3个月后即可在腹膜上出现AGEs的沉积[3]。随着透析时间的延长，这种沉积变得更显著、更广泛。当换用非葡萄糖PDS进行透析一段时间后，透出液中AGEs含量可明显下降，提示葡萄糖PDS的应用是AGEs形成的主要原因[4]。进一步的研究发现，传统的葡萄糖PDS在加热消毒过程中产生大量的葡萄糖降解产物，这是PDS导致AGEs形成的主要原因[5]

8、。有人发现大于85%的咪唑啉酮和大于70%的羧甲基赖氨酸主要于葡萄糖降解产物，而由于高糖本身导致的AGEs仅占很少一部分，并发现使用非传