发酵黄芪对balb-c小鼠免疫功能及细胞因子的作用

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1、发酵黄芪对BALB/C小鼠免疫功能及细胞因子的作用：王晓波，刘殿武2，郭丽莉，王本华【摘要】目的研究发酵黄芪对小鼠免疫功能及细胞因子的影响。方法将小鼠随机分成正常对照组、免疫抑制组、黄芪对照组和发酵黄芪低、中、高3个剂量组(剂量分别为1，2，5g/kg)，饮水法喂饲小鼠，分别检测以下指标:小鼠胸腺和脾脏指数，淋巴细胞亚群，淋巴细胞增殖功能，腹腔巨噬细胞吞噬功能、IL-1、IL-2分泌。结果与免疫抑制对照组比较，发酵黄芪高、中剂量能显著促进淋巴细胞的转化，使CD3、CD4、CD4/CD8明显上调，促进小鼠腹腔

2、巨噬细胞吞噬能力，促进白介素-1(IL-1)和白介素-2(IL-2)的产生(P均<0.05)。结论发酵黄芪能提高机体的免疫功能，其作用机制与激活T细胞、T淋巴细胞亚群、巨噬细胞功能及促进细胞因子分泌有关。【关键词】发酵黄芪;免疫功能;细胞因子;小鼠　黄芪作为常用的补益类中药，具有补气固表及健脾利肺的功效。目前国内外现代研究也已证实，黄芪含有多糖、苷类、生物碱、黄酮、微量元素及其氨基酸等成分具有调节机体免疫功能的作用[1，2]。为了进一步开发传统的中药剂型，研究发酵黄芪对小鼠免疫系统及功能的作用，对传统

3、中药的二次开发提供理论及应用的可行性依据。　　1材料与仪器　　1.1动物及细胞株健康BALB/C小鼠，雌雄各半7～8周龄，体质量18～22g，由河北医科大学实验动物中心提供;C57BL/6，雌性体质量18～20g，一级动物，合格证号：冀医动字第04035号。　　1.2药品与试剂发酵黄芪由保定生物公司提供。RPMI-1640培养基、小牛血清：美国GIBCO公司;胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、刀豆蛋白(ConA)为Sigma公司产品。抗Thy1、2;抗LST4、抗Lyt2美国FLUKA公司;环磷酰胺，上海第二制药

4、厂制造，(CycloPhosPhamide，CP)。二甲基亚砜(DMSO)购于上海化学试剂公司，其余试剂均为分析纯。　　1.3仪器倒置显微镜(PM-10AD)，OLYMOUS日本。二氧化碳孵箱(TC2323，美国SHEL.LAB公司);酶标仪(奥地利公司)。流式细胞仪，美国(FACS-420)。　　2方法　　2.1动物分组处理与给药BALB/C小鼠随机分成6组，每组7只动物，分别为生理盐水对照组、环磷酰胺组、黄芪对照组、发酵黄芪小剂量组(1g/kg)、中剂量组(2g/kg)和高剂量组(5g/kg)。黄芪组(

5、1g/kg)每天每只灌服0.5ml，对照组灌服等量生理盐水。环磷酰胺组ip给药连续3d造模。第8天各组颈椎脱臼处死小鼠，无菌取胸腺、脾测定。　　2.2脏器/体重比值测定实验结束，称质量、胸腺重、脾重，取小鼠脾脏和胸腺称重(湿重)，计算脏器指数(%)=脏器重量(g)/动物质量(g)×100%。　　2.3小鼠脾细胞悬液的制备及脾淋巴细胞活力的检测采用MTT法[3]小鼠分组与喂饲方法同上。无菌取脾，经过研磨200目细胞筛网过滤、经常规裂解红细胞，hank's液洗涤，离心2次，制得单细胞悬液，最后用含10%小牛血清

6、RPMI-1640调细胞浓度5×106个/ml，接种于96孔板(100μl/孔)，每组6个平行孔，每孔100μl。37℃保湿培养68h后，每孔加MTT10μl，继续培养4h后，每孔加入DMSO150μl，振荡5min，紫色结晶完全溶解后于酶标仪570nm测定A值。　　2.4小鼠脾细胞亚群测定(流式细胞仪)[4]将6～8周龄、体质量(20±2)gBALB/C雌性小鼠随机分成6组，每组6只。无菌取小鼠胸腺细胞，4%甲醛固定，预冷PBS清洗，加入荧光标记的CD3、CD4、CD8单克隆抗体50μl，37℃30min

7、，1000r/min离心10min，加入荧光标记的二抗工作液50μl，37℃30min，RNase消化，1ml碘化丙啶，每份样本平均测定1×104个，分析相应阳性细胞的含量。　　2.5小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定[5]小鼠分组与喂饲方法同上。按常规制备小鼠腹腔巨噬细胞，置24孔培养板每孔加细胞悬液1ml，5%CO2，37℃培养2h，去上清液，用RPMI1640培养液洗去未贴壁细胞，每孔加入0.1%中性红生理盐水液1ml，5%CO2，37℃培养2h后，甩弃中性红，并用预温的BPS清洗未吸收的中性红，吸水纸吸干

8、，每孔加入细胞裂解液1ml，静置4℃过夜，用蒸馏水调零，于722分光光度计550nm处测定吸光度A值，A值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。　　2.6腹腔巨噬细胞产生IL-1的诱生及测定[5]小鼠分组与喂饲方法同上。将24孔板中贴壁纯化的腹腔巨噬细胞各孔加入LPS(终浓度10μg/ml)培养24h后收获上清，为诱生的IL-1粗品，-20℃保存待测。无菌取C57BL/6小鼠胸腺细胞，用10%小牛血清的RPMI-1640清