二氯化钴诱导大鼠肝癌细胞缺氧与凋亡和增殖的研究

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1、二氯化钴诱导大鼠肝癌细胞缺氧与凋亡和增殖的研究【摘要】　　目的：了解大鼠肝癌细胞系CBRH7919在缺氧状态下凋亡和增殖的关系，探讨低氧诱导因子（hypoxiainducedfactor,HIF-1α）在此诱导过程中的作用。方法：二氯化钴（CoCl2）作为缺氧诱导剂。利用RT-PCR和免疫细胞化学法检测CBRH7919细胞HIF-1α在转录水平和翻译水平的表达，利用流式细胞仪检测CBRH7919细胞在不同缺氧程度下细胞凋亡率、细胞周期和线粒体膜电位的变化。结果：（1）随缺氧程度的加重，HIF-1α在转录和翻译水平的表达逐渐增加；（2）流式细胞仪结果显示经300μMCoCl2分别

2、处理0、4、24小时后细胞凋亡率分别为（2.31±1.1）%、（5.62±2.4）%、（21.2±7.5）%。对照组和4小时处理组细胞周期改变不显著，24小时处理组出现显著G0/G1期阻滞。处理组细胞线粒体膜电位较对照组有不同程度的降低。结论：大鼠肝癌细胞随着缺氧程度的加重，细胞凋亡明显增加，伴随细胞周期进入G0/G1阻滞及线粒体膜电位降低；HIF-1α的表达增加在此过程中发挥重要作用。【关键词】肝癌细胞缺氧凋亡低氧诱导因子　　[Abstract]Objective:Toinvestigatetheapoptosisandproliferationofhepatocellula

3、rcarcinomacellsinducedbyhypoxia,andtostudytheroleofHIF-1αintheinductioncourse.Methods:CBRH7919cellsmunocytochemistry.Thechangeofcellcycle,membranepotentialofmitochondriaandapoptoticratioetry.Results:HIF-1αitochondriamembranepotential.Conclusion:Cobaltdichloridecaninduceapoptosisofrathepatoce

4、llularcelllineCBRH7919,andHIF-1αplaysanimportantroleinthishypoxia-inducedapoptosis.　　[Keyacell;Hypoxia;Apoptosis,Hypoxiainduciblefactor　　氧稳态的维持是细胞生命活动的基本前提。低氧诱导因子（hypoxiainduciblefactor，HIF）在缺氧的情况下被激活，是最重要的低氧信号转录调节因子[1，2]。本实验从缺氧诱导大鼠肝癌细胞凋亡和增殖的角度，初步探讨HIF-1α在缺氧环境下的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系。　　1材料和方法　　1.1材

5、料大鼠肝癌细胞系CBRH7919购自中科院上海细胞生物学研究所,二氯化钴（CoCl2）购自汕头化学试剂公司（分子量237.93），SP免疫组化试剂盒购自北京中山试剂公司，单克隆抗体HIF-1α购自Neomarkers，TrizolRna购自Invitrogen，RT-PCR试剂盒购自TaKaRa，AnnexinV-FITC试剂盒购自BeckmanCoulter。余试剂及仪器均由天津市肿瘤研究所中心实验室提供。　　1.2方法免疫组化步骤参考SP试剂盒说明，采用DAB显色，高倍光镜观察，阳性细胞的胞核可见棕黄色染色，部分胞浆也可染色。细胞总RNA的提取按照TRIzolRNA提取试剂

6、盒说明，分光光度法检测提取RNA的纯度和浓度。引物的设计：　　HIF-1α（扩增长度168bp）　　上游：5'-GGACAAGTCACCACAGGA-3'；　　下游：5'-GGAGAAAATCAAGTCGTG-3'。　　β-actin（扩增长度114bp）　　上游：5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'；　　下游：5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'。取PCR反应产物5μl，进行1%琼脂糖凝胶电泳，在kodak440凝胶成像系统照相并测定各条带吸光度A值。细胞凋亡率和细胞周期的检测参考AnnexinV-FITCKit试剂盒说明。将含有终浓度为10μ

7、g/ml罗丹明123的无FBS培养基重悬细胞沉淀，在488nm波长的激发光下检测细胞荧光强度。　　1.3统计学方法实验数据采用SPSS13.0统计软件分析，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。　　2.2流式细胞仪结果显示经300μMCoCl2分别处理0、4、24h后细胞凋亡率分别为（2.31±1.1）%、（5.62±2.4）%、（21.2±7.5）%，24h处理组与对照组和4小时处理组差异均有统计学意义（P<0.05）。细胞周期G0/G1%分别为（45.0±5.7