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时间:2018-09-02
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1、二氯化钴诱导大鼠肝癌细胞缺氧与凋亡和增殖的研究【摘要】 目的:了解大鼠肝癌细胞系CBRH7919在缺氧状态下凋亡和增殖的关系,探讨低氧诱导因子(hypoxiainducedfactor,HIF-1α)在此诱导过程中的作用。方法:二氯化钴(CoCl2)作为缺氧诱导剂。利用RT-PCR和免疫细胞化学法检测CBRH7919细胞HIF-1α在转录水平和翻译水平的表达,利用流式细胞仪检测CBRH7919细胞在不同缺氧程度下细胞凋亡率、细胞周期和线粒体膜电位的变化。结果:(1)随缺氧程度的加重,HIF-1α在转录和翻译水平的表达逐渐增加;(2)流式细胞仪结果显示经300μMCoCl2分别处理0、4、
2、24小时后细胞凋亡率分别为(2.31±1.1)%、(5.62±2.4)%、(21.2±7.5)%。对照组和4小时处理组细胞周期改变不显著,24小时处理组出现显著G0/G1期阻滞。处理组细胞线粒体膜电位较对照组有不同程度的降低。结论:大鼠肝癌细胞随着缺氧程度的加重,细胞凋亡明显增加,伴随细胞周期进入G0/G1阻滞及线粒体膜电位降低;HIF-1α的表达增加在此过程中发挥重要作用。【关键词】肝癌细胞缺氧凋亡低氧诱导因子 [Abstract]Objective:Toinvestigatetheapoptosisandproliferationofhepatocellularcarcinomace
3、llsinducedbyhypoxia,andtostudytheroleofHIF-1αintheinductioncourse.Methods:CBRH7919cellsweretreatedwith300μMCoCl2for0,4and24hours.TheexpressionsofHIF-1αatthelevelsoftranscriptionandtranslationweredetectedbyRT-PCRandimmunocytochemistry.Thechangeofcellcycle,membranepotentialofmitochondriaandapoptotic
4、ratioweredetectedbyflowcytometry.Results:HIF-1αwasupregulatedbothatthetranscriptionalandtranslationallevelsunderhypoxiccondition.ApoptoticratiosofCBRH7919cellswere(2.31±1.1)%,(5.62±2.4)%and(21.2±7.5)%respectively.CBRH7919cellsappearednotablecellarrestatG0/G1phaseunderseverelyhypoxia.Therewasalsoad
5、ecreaseinthemitochondriamembranepotential.Conclusion:CobaltdichloridecaninduceapoptosisofrathepatocellularcelllineCBRH7919,andHIF-1αplaysanimportantroleinthishypoxia-inducedapoptosis. [Keywords]Hepatocellularcarcinomacell;Hypoxia;Apoptosis,Hypoxiainduciblefactor 氧稳态的维持是细胞生命活动的基本前提。低氧诱导因子(hypoxia
6、induciblefactor,HIF)在缺氧的情况下被激活,是最重要的低氧信号转录调节因子[1,2]。本实验从缺氧诱导大鼠肝癌细胞凋亡和增殖的角度,初步探讨HIF-1α在缺氧环境下的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系。4 1材料和方法 1.1材料大鼠肝癌细胞系CBRH7919购自中科院上海细胞生物学研究所,二氯化钴(CoCl2)购自汕头化学试剂公司(分子量237.93),SP免疫组化试剂盒购自北京中山试剂公司,单克隆抗体HIF-1α购自Neomarkers,TrizolRna购自Invitrogen,RT-PCR试剂盒购自TaKaRa,AnnexinV-FITC试剂盒购自BeckmanC
7、oulter。余试剂及仪器均由天津市肿瘤研究所中心实验室提供。 1.2方法免疫组化步骤参考SP试剂盒说明,采用DAB显色,高倍光镜观察,阳性细胞的胞核可见棕黄色染色,部分胞浆也可染色。细胞总RNA的提取按照TRIzolRNA提取试剂盒说明,分光光度法检测提取RNA的纯度和浓度。引物的设计: HIF-1α(扩增长度168bp) 上游:5'-GGACAAGTCACCACAGGA-3'; 下游:5'-GGAGAAAAT
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