地塞米松对急性过敏性哮喘小鼠肺水通道蛋白1的影响

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1、地塞米松对急性过敏性哮喘小鼠肺水通道蛋白1的影响：吴葆菁，李文益，檀卫平，麦贤弟，黄花荣，李静【摘要】【目的】观察水通道蛋白1(AQP1)在急性过敏性哮喘小鼠肺组织的改变，以及地塞米松对其的影响。【方法】建立小鼠哮喘模型，并随机分为3组，哮喘模型组、生理盐水对照组和治疗组，治疗组在激发阶段给予地塞米松治疗。检测各组中支气管肺泡灌洗液（BALF）的白细胞总数、分类计数以及IL-5和IFN-γ水平，用RT-PCR、BIFermentas，America），小鼠IL-5、干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、兔抗鼠AQP1多克隆抗体、生物素标

2、记的羊抗兔链霉亲合素生物素酶复合物（武汉博士德工程有限公司），PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.3实验方法1.3.1动物分组30只C57BL/6小鼠随机分为3组，分别为OVA致敏/激发组（哮喘组）、生理盐水对照组（对照组）、地塞米松(dexamethasone，DM)治疗组（DM组），每组10只。1.3.2急性哮喘动物模型建立急性哮喘动物模型的建立:方法采用国外文献［5］的方法加以改进，哮喘组、DM组分别于当天及第14天腹腔注射新鲜配制的1g/LOVA与100g/L氢氧化铝混悬溶液0.2mL(1g/LOVA0.1mL+100g/L氢氧化铝0.1mL

3、)致敏，在21、22、23、29和30d予1g/LOVA溶液50μL滴鼻吸入激发哮喘，小鼠出现烦躁不安或安静少动、呼吸加深加快，弓背，前肢缩抬、腹肌痉挛等阳性反应；DM组在2l、22、23、29和30d滴鼻激发前30min予地塞米松1.2mg/kg腹腔注射；对照组同时给予相同体积生理盐水腹腔注射及滴鼻。1.3.3标本采集最后1次滴鼻吸入激发后24～48h，麻醉小鼠，剪开颈部皮肤，暴露气管、分离气管，经气管缓缓插入套管针，结扎固定，用1mL注射器吸取0.6mL磷酸盐平衡溶液（PBS），通过套管将PBS缓慢注入肺内，缓慢回抽，反复3次，收集全部支气管肺泡灌洗液（b

4、ronchoalveolarlarvagefluid，BALF）1.0～1.2mL，回收率>80%。取0.1mLBALF于血细胞计数板中计算细胞总数，其余BALF离心(1500r/min，r=15cm,4℃，10min)，上清液保存于-80℃冰箱待测细胞因子；沉渣涂片进行细胞分类(计数200个细胞)，计算中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞的百分比，用细胞总数乘以百分比得各类细胞的绝对数。右肺上叶组织放入100g/L中性福尔马林溶液固定，24h内完成石蜡包埋；其余肺组织先放入液氮，后置于-70℃冰箱保存备用。1.3.4BALF细胞因子含量测定用ELISA法测

5、定BALF上清液中IL-5和IFN-γ水平。1.4RT-PCR检测AQPmRNA的表达用Trizol法提取肺组织总RNA，取3μg总RNA进行逆转录，取1μgcDNA，加入AQPs引物，用Taq酶进行扩增，PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃（AQP1）、53℃（β-actin）退火30s，72℃延伸40s，72℃最后延伸10min，35个循环。RT-PCR产物以20g/L琼脂糖电泳，以β-actin为内参照，采用UVIgelstart图像分析软件测定各条带积分光密度(IOD)值，以AQP/β-actin的IOD比值表示AQPmRNA

6、表达的相对强度。1.5厚，行HE及阿新蓝(AB)染色。1.7肺组织免疫组化组织切片滴加30g/LH2O2，室温10min，30g/L牛血清白蛋白和50g/L正常羊血清封闭60min，PBS冲洗。加入1∶200兔抗鼠AQP1多克隆抗体，4℃过夜、漂洗。滴加生物素标记的二抗链霉亲合素生物素酶复合物，浓度为1∶500，37℃，20min，PBS洗3次，滴加SABC试剂，20～37℃，60min，PBS洗4次。二氨基联苯胺显色。苏木素复染、脱水、透明、封片。用PBS代替一抗为阴性对照。2.1肺组织形态和黏液改变光镜下所见:哮喘组肺组织可见较弥漫的间质炎性改变，细支气管

7、周围、支气管下黏膜和血管周围有大量的炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主，上皮细胞部分有脱落，黏液分泌增多，部分可见黏液栓子，血管壁明显水肿，血管周围炎性渗出物明显增多，并可见出血。地塞米松治疗后肺部炎症细胞浸润、黏液分泌、血管壁水肿、血管周围渗出的程度明显轻于哮喘组（图1）。2.2BALF中细胞总数及分类计数的变化哮喘组白细胞总数和嗜酸性粒细胞数均高于正常对照组(P均<0.01)；DM组白细胞总数、嗜酸性粒细胞数和淋巴细胞均低于哮喘组(P<0.05，P<0.01，P<0.01，表2）。2.3BALF中IL-5和IFN-γ水平的比

8、较哮喘组L-5水平高于正常对照组(P&