tgfβ1、tgfβr1、smad4在乳腺癌发生、发展中的作用及其相互关系

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1、TGFβ1、TGFβR1、Smad4在乳腺癌发生、发展中的作用及其相互关系：夏立平，刘晓力，陈国平，郑武平，何冬雷，高炳玉【摘要】　　目的：探讨TGFβ1、TGFβR1及Smad4三者在乳腺癌中的表达与其发生、发展、转移等生物学行为以及预后的关系，为乳腺癌发病和治疗机制提供理论和实验依据。方法：提取30例乳腺癌临床标本（经液氮、研磨等处理）和MCF7、T47D、SKBR3三种乳腺癌细胞（取指数增长期细胞）总RNA，反转录cDNA第一链，克隆TGFβR1、Smad4基因片段，测定质粒浓度，制备标准样品，并作

2、出标准曲线，探针法荧光定量PCR（FQPCR）检测TGFβR1和Smad4基因mRNA表达。结果：FQPCR检测发现恶性程度高的SKBR3细胞，其TGFβR1和Smad4的基因拷贝数明显低于恶性程度低的MCF7细胞（P均＜0.01），T47细胞两种基因拷贝数介于两者之间。结论：随着乳腺癌细胞病理类型恶性程度增加，TGFβR1和Smad4mRNA表达逐步下降，表明TGFβ1和Smad4可能具有类似乳腺癌抑癌基因的作用。【关键词】转化生长因子β1;转化生长因子β1受体;Smad4;乳腺癌　　［ABSTRAC

3、T］Objective:ToinvestigatetheexpressionofTGFβ1,TGFβR1andAmad4proteinsandtherelationshiptotheinitiation,progression,metaptosisandprognosisofbreastcancer.Methods:Thesamplesof30casesand3celllines(MCF7,T47D,SKBR3)ofbreastcancerRNAad4genescloningideasured,standard

4、curveade,andtheexpressionofTGFβR1andSmad4mRNAsachine.Results:ThegenecopiesofTGFβR1andSmad4inSKBR3cellsiddle.Conclusions:OurstudiesbyFQPCRshoad4mRNAsexpression,thead4actpossiblyastheroleofantioncogeneinbreastcancer.　　［KEYCF7、T47D、SKBR3细胞为本实验室保存。正常对照：选取非乳腺癌

5、患者正常乳腺组织手术切除标本10例作为对照。　　1.1.2质粒和细菌　　pGEMTTGFβR1、pGEMTSmad4质粒构建按照pGEMT载体试剂盒（公司）的说明。大肠杆菌DH5α为本实验室保存。　　1.1.3引物和探针　　以Genebank中Smad4和TGFβR1基因的mRNA序列作参考，各设计一对引物和一条探针。⑴Smad4上游引物(P1)：5′GTCGAAAACAACGCTATTGACT3′；下游引物(P2)：5′CAGAGAATTGTCGCCGTACAT3′；荧光探针：5′TCAGGAC

6、GCGATACCTCGGTATACC3′。⑵TGFβR1上游引物(P1)：5′GAACGACAACGATTCAACT3′；下游引物（P2）：5′GCAACACGATCATGACTT3′；荧光探针为5′TCTACGTAATAGCATGCGCCAAAT3′。　　探针5′端标记的荧光报告基团均为FAM，3′端标记的荧光淬灭基团均为TAMRA。引物及探针均由英俊公司合成。　　1.1.4主要试剂　　RPMI1640培养基（GIBCOBRL公司）；无支原体胎牛血清（杭州四季青公司）；HEPES粉（ASBC进口分装

7、）；PBS缓冲液（NaCl8.0g,Na2HPO4·12H2O3.63g,KH2PO40.2g,pH7.4，自配）；胰蛋白酶（Sigma公司）；EDTA（公司）；TRIzolReagent（Invitrogen公司）；DEPC（威佳公司）；氯仿（国产）；异丙醇（国产）；RT试剂盒（Fermentas公司）；Taq酶（Progema公司）；DNAMarker（威佳公司）；GelEstrationKit和小量质粒抽提试剂盒（QIAGEN公司）；PCR产物纯化试剂盒（博彩生物公司）。　　1.1.5仪器　　二氧化碳孵箱（Her

8、eausB5060EK/CO2）；倒置相差生物显微镜（Olympus公司）；紫外/可见光分光光度计（BeckmanDU530）；荧光定量PCR仪（ABI公司）；数显调速多用振荡器（江苏金坛荣华仪器制造有限公司）；台式低温高速离心机（Hermle和Beckman公司）；PCR扩增仪（PE9600）；多功能恒温恒压恒流电泳系统（Bio