lkb1基因转染对人肺腺癌细胞生物学行为的影响

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1、LKB1基因转染对人肺腺癌细胞生物学行为的影响：梁璇,南克俊,李春丽,姚煜,田涛,王淑红【摘要】　　目的:探讨外源性LKB1基因表达对人肺腺癌细胞生物学行为的影响。方法:应用巢式PCR方法扩增LKB1基因编码区,利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNALKB1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,)分析其细胞周期及其凋亡的变化。结果:成功获得了稳定表达外源性LKB1基因的A549细胞系,与转染空白载体组比较,转染LKB1基因的细胞生长速度明显减慢,细胞周期

2、中G1/G0期比例明显增加,S期比例减少,细胞凋亡率升高;同时STAT3蛋白的磷酸化水平明显降低。结论:LKB1可能通过下调STAT3蛋白磷酸化水平的表达从而抑制A549细胞的恶性生物学行为。　　AIM:TodeterminetheeffectsofexogenousLKB1geneonbiologicalbehavioroflungcarcinomacells.METHODS:NestPCRation.Cellcycleandapoptosisetry(FCM).RESULTS:A549cellsstablyex

3、pressingLKB1proteinoresloorepositiveclonecellsightinhibitmalignantbiologicalbehaviorofA549cellspartlybydoine2000、G418购自Invitrogen公司;质粒提取试剂盒购自Promega公司;蛋白裂解液购自PIERCE公司;鼠抗人His*Tag单克隆抗体(mAb)购自Novagen公司;鼠抗人actin抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠、羊抗兔二抗购自北京中杉试剂公司;兔抗人STAT多克隆抗体购自S

4、antaCrus公司;预染蛋白质分子量标准、限制性内切酶、T4DNALigase购自Nein后进人20个PCR循环(94℃10s,60℃10s,72℃90s)72℃7min,4℃保存。10g/L琼脂糖电泳鉴定PCR扩增产物。PCR产物纯化后与pcDNA3.1质粒用HindⅢ和BamHⅠ双酶切、连接、转化DH5α感受态细胞,挑菌测序。　　1.2.2表达外源性LKB1基因肺癌细胞模型的建立按试剂盒提取纯化pcDNALKB1和pcDNA质粒,定量后按照Lipofectamine2000的说明书转染A549细胞。转染24

5、h后按1×105个细胞接种于60mm的培养皿中,G418（600mg/L）筛选阳性克隆,每3d更换1次培养液,16d左右有克隆形成。挑取单克隆进行扩增,以G418（300mg/L）维持,提取总蛋白行）检测细胞周期变化,每标本检测105个细胞,实验重复3次。AnnexinV和PI双染法参照试剂盒的说明书进行:调细胞密度约109/L,取480μL细胞悬液,加入10μLAnnexinVFITC和10μLPI混匀,室温下避光孵育15min,以FCM检测分析细胞的凋亡和坏死。　　1.2.5统计学分析采用SPSS10.0软件

6、进行统计分析。计数资料结果用x±s表示,两均数的比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1LKB1基因的扩增及鉴定初级PCR产物在约1900bp处有条带,但其下游有杂带（图1A）。将初级PCR产物稀释后行巢式PCR,在1300bp处有明亮条带,无杂带,阴性对照组未见条带(图1B),提示采用巢式PCR成功扩增了LKB1基因片段。　　图1LKB1基因的PCR产物鉴定（略）　　Fig1ElectrophoresisofPCRproductofLKB1gene　　A:FoundamentalP

7、CRforLKB1gene;B:NestPCRforLKB1gene.M:DL2000DNAmarkerr;1:LKB1genePCRproduct;2:Negativecontrol.　　2.2表达外源性LKB1基因的细胞模型的建立将pcDNALKB1质粒和空白质粒转染A549细胞,经G418筛选后得到稳定表达的1、2、3号克隆,Westernblot检测LKB1基因的表达情况。结果显示转染阳性质粒的克隆株细胞的LKB1基因表达水平明显增高,其中3号克隆株效果最明显（图2）。因此后续实验选用3号克隆株细胞。　　

8、2.3LKB1基因表达对肺癌细胞生物学行为的影响　　2.3.1LKB1获得性表达后细胞的生长曲线稳定转染pcDNALKB1质粒的3号细胞株和对照细胞的生长曲线表明获得性表达外源性LKB1基因的肺癌细胞的生长、增殖能力明显受到抑制,其增殖速度明显低于对照细胞（图3）。　　图3肺癌细胞获得性表达LKB1基因后的生长曲线图（略）　　Fig3Groacellstr