差异性应激对青、老年大鼠海马hsp70mrna表达的影响

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1、差异性应激对青、老年大鼠海马HSP70mRNA表达的影响【关键词】应激；强迫游泳；热休克蛋白70mRNA；海马应激引起多种组织器官的热休克蛋白(HSP)家族表达水平增加，且表达程度与应激强度和时程有关〔1〕，其中HSP70是表达范围最广泛、表达量最多的一组。应激源类型、机体衰老程度与性别等与HSP70表达有密切关系。随着年龄的增加，细胞合成HSP70的能力降低〔2〕。但目前改变应激强度和时程条件对不同衰老大鼠HSP70表达的影响尚未见报道。本文旨在检测差异性应激对不同月龄大鼠海马HSP70mRNA表

2、达的影响。　　1材料与方法　　1.1动物　　青年组2月龄雄性×40cm×80cm）中强迫游泳8min，1次/d，共8次。B与b组：低强度重复应激＋强应激组(去习惯化组)：第1～7天，每天上午8：00开始，将实验动物逐一放入水深25cm，水温25℃的玻璃水缸中强迫游泳8min，每天1次，共7次；第8天上午8：00开始，将实验动物逐一放入盛有4℃冰水混合物的玻璃缸中强迫游泳8min。C与c组：对照组，相同饲养条件下。每次强迫游泳结束后，都将动物放回原笼中，自由饮食、进水，直至下次期间保持大鼠尽可能不受外

3、界刺激。　　1.3组织取材与组织总RNA提取（Trizol一步提取法）　　每组大鼠于急性刺激后第0、30、60、180、30min各随机选取3只，用2%戊巴比妥钠（40mg/kg）经腹腔麻醉后，由大鼠颈后开颅取脑，分离海马组织，迅速放入-80℃冰箱冻存。称取约100mg的组织放入研磨器中加入1mlTrizol，反复研磨后放置5min，加入氯仿剧烈振摇，离心后转移上清至Eppendonf管中加入异丙醇放置10min，8000r/min离心10min，弃上清，用75%乙醇洗沉淀，混匀后离心倒掉乙醇，空气

4、中干燥，用DEPC水溶解RNA，-80℃冰箱中保存。　　　　1.4RTPCR法检测HSP70mRNA表达　　HSP70（350bp）引物前向:5′CGCGACCTGAACAAGAGCAT3′，反向：5′TCGAAGGTCACCTCGATCTG3′；βactin（500bp）引物前向：5GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′,反向：5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3′；94℃预变性3min后，94℃30s，55℃1min，72℃1min，扩增28个循环，72℃

5、延伸10min后终止反应，扩增产物4℃冰箱保存待分析。取HSP70mRNA扩增产物5μl和βactinPCR扩增产物2μl加入同一点样孔进行1.7%的琼脂糖凝胶电泳，电压80V，时间45min，然后用SmartVieRNA带峰面积与内参照βactin带峰面积比值表示HSP70mRNA相对表达量，并记录数据。　　1.5统计学处理　　应用SPSS11.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，组间比较用t检验。　　2结果　　2.1慢性应激对不同大鼠海马HSP70mRNA表达的影响　　老年A组与青年a组大

6、鼠接受连续8d强迫25℃温水游泳后，海马HSP70mRNA表达立即增加，其中老年A组大鼠HSP70mRNA表达量在应激后的0、30、60、180、360min各时点均高于老年C组(0.061±0.005)，且在0、30、60、180min4个时点差异显著（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.05，P＜0.001）；慢性应激青年组大鼠海马HSP70mRNA相对表达量在应激后的0、30、60、180、360min各个时点分别均高于青年c组(0.488±0.023)，但仅在60和180min时点差异显

7、著（均P＜0.001）。青年a组大鼠海马HSP70mRNA相对表达量在应激后0、30、60、180、360min各个时点的相对表达量分别为0.528±0.075、0.490±0.012、0.777±0.012、0.749±0.008、0.541±0.064；老年A组则分别为0.143±0.004、0.277±0.07、0.120±0.012、0.122±0.007、0.088±0.016，均低于青年a组大鼠，且在30、60、180、360min时差异显著（均P＜0.001）。　　2.2差异性应激对不

8、同月龄大鼠海马HSP70mRNA表达的影响　　老年B组大鼠在应激后0、30、60、180、360min各时点海马HSP70mRNA相对表达量分别为0.528±0.003、0.546±0.014、0.594±0.008、0.726±0.007、0.609±0.051，均高于老年A组，且差异显著（均P＜0.001）；青年b组大鼠在应激后0、30、60、180、360min各时点海马HSP70mRNA的相对表达量分别为0.685±0.015、0.760±0.003、0.80