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时间:2018-05-02
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1、差异性应激对青、老年大鼠海马HSP70mRNA表达的影响【关键词】应激;强迫游泳;热休克蛋白70mRNA;海马应激引起多种组织器官的热休克蛋白(HSP)家族表达水平增加,且表达程度与应激强度和时程有关〔1〕,其中HSP70是表达范围最广泛、表达量最多的一组。应激源类型、机体衰老程度与性别等与HSP70表达有密切关系。随着年龄的增加,细胞合成HSP70的能力降低〔2〕。但目前改变应激强度和时程条件对不同衰老大鼠HSP70表达的影响尚未见报道。本文旨在检测差异性应激对不同月龄大鼠海马HSP70mRNA表
2、达的影响。 1材料与方法 1.1动物 青年组2月龄雄性×40cm×80cm)中强迫游泳8min,1次/d,共8次。B与b组:低强度重复应激+强应激组(去习惯化组):第1~7天,每天上午8:00开始,将实验动物逐一放入水深25cm,水温25℃的玻璃水缸中强迫游泳8min,每天1次,共7次;第8天上午8:00开始,将实验动物逐一放入盛有4℃冰水混合物的玻璃缸中强迫游泳8min。C与c组:对照组,相同饲养条件下。每次强迫游泳结束后,都将动物放回原笼中,自由饮食、进水,直至下次期间保持大鼠尽可能不受外
3、界刺激。 1.3组织取材与组织总RNA提取(Trizol一步提取法) 每组大鼠于急性刺激后第0、30、60、180、30min各随机选取3只,用2%戊巴比妥钠(40mg/kg)经腹腔麻醉后,由大鼠颈后开颅取脑,分离海马组织,迅速放入-80℃冰箱冻存。称取约100mg的组织放入研磨器中加入1mlTrizol,反复研磨后放置5min,加入氯仿剧烈振摇,离心后转移上清至Eppendonf管中加入异丙醇放置10min,8000r/min离心10min,弃上清,用75%乙醇洗沉淀,混匀后离心倒掉乙醇,空气
4、中干燥,用DEPC水溶解RNA,-80℃冰箱中保存。 1.4RTPCR法检测HSP70mRNA表达 HSP70(350bp)引物前向:5′CGCGACCTGAACAAGAGCAT3′,反向:5′TCGAAGGTCACCTCGATCTG3′;βactin(500bp)引物前向:5GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′,反向:5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3′;94℃预变性3min后,94℃30s,55℃1min,72℃1min,扩增28个循环,72℃
5、延伸10min后终止反应,扩增产物4℃冰箱保存待分析。取HSP70mRNA扩增产物5μl和βactinPCR扩增产物2μl加入同一点样孔进行1.7%的琼脂糖凝胶电泳,电压80V,时间45min,然后用SmartVieRNA带峰面积与内参照βactin带峰面积比值表示HSP70mRNA相对表达量,并记录数据。 1.5统计学处理 应用SPSS11.0统计软件进行分析,数据以x±s表示,组间比较用t检验。 2结果 2.1慢性应激对不同大鼠海马HSP70mRNA表达的影响 老年A组与青年a组大
6、鼠接受连续8d强迫25℃温水游泳后,海马HSP70mRNA表达立即增加,其中老年A组大鼠HSP70mRNA表达量在应激后的0、30、60、180、360min各时点均高于老年C组(0.061±0.005),且在0、30、60、180min4个时点差异显著(P<0.001,P<0.001,P<0.05,P<0.001);慢性应激青年组大鼠海马HSP70mRNA相对表达量在应激后的0、30、60、180、360min各个时点分别均高于青年c组(0.488±0.023),但仅在60和180min时点差异显
7、著(均P<0.001)。青年a组大鼠海马HSP70mRNA相对表达量在应激后0、30、60、180、360min各个时点的相对表达量分别为0.528±0.075、0.490±0.012、0.777±0.012、0.749±0.008、0.541±0.064;老年A组则分别为0.143±0.004、0.277±0.07、0.120±0.012、0.122±0.007、0.088±0.016,均低于青年a组大鼠,且在30、60、180、360min时差异显著(均P<0.001)。 2.2差异性应激对不
8、同月龄大鼠海马HSP70mRNA表达的影响 老年B组大鼠在应激后0、30、60、180、360min各时点海马HSP70mRNA相对表达量分别为0.528±0.003、0.546±0.014、0.594±0.008、0.726±0.007、0.609±0.051,均高于老年A组,且差异显著(均P<0.001);青年b组大鼠在应激后0、30、60、180、360min各时点海马HSP70mRNA的相对表达量分别为0.685±0.015、0.760±0.003、0.80
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