独特型tcr vα1pirestcr vβ8表达载体构建及体外表达

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1、独特型TCRVα1pIRESTCRVβ8表达载体构建及体外表达：李闯,吴秀丽,李扬秋,周羽竝,陈少华,杨力建,朱康儿【摘要】　　目的:构建Jurkat细胞株独特型TCRVα1pIRESTCRVβ8表达载体,转染后了解其体外表达情况。方法:根据聚合酶链反应基因扫描（PCRGenescan）检测Jurkat细胞株TCRVα及Vβ亚家族表达情况,分别将其所表达的单克隆性的TCRVα1及TCRVβ8亚家族基因片段克隆至质粒pIRES的多克隆位点A（MCSA)和多克隆位点B（MCSB)中。通过限制性酶切分析、序列分析、RTPCR、间接免疫荧光、流式细胞术(FCM)手段鉴

2、定重组表达载体的正确性以及转染A549和Molt4细胞后基因及蛋白的表达情况。结果:构建了2组TCRVα1pIRESTCRVβ8表达载体,该表达载体转染A549和Molt4细胞后,在mRNA和蛋白水平检测到了TCRVα1和TCRVβ8的表达。结论:成功构建了2种独特型Vα1pIRESTCRVβ8真核表达载体,为利用特异性TCR基因修饰T细胞的研究提供方法学依据。【关键词】Jurkat细胞株T细胞受体转基因　　[Abstract]AIM:ToconstructtheeukaryoticvectorsiliesofJurkatcellsonoclonalTCRVα1an

3、dVβ8genesofJurkatcellsultipleclonesite(MCS)AandMCSBoftheeukaryoticvectorpIRESrespectively.Itssequencesecuttingandsequenceanalysis.TheexpressionofTCRmRNAandidiotypicproteinintransferredA549andMolt4cellsmunophenotypingfluoresceindyeingandfloetry,respectively.RESULTS:TRNAandproteinethodforfur

4、thorstudyofthespecificTCRgenemodifiedTcells.　　[Keyentarydeterminingregion3,CDR3）已经是常规应用于了解T细胞所表达的亚家族和克隆性的技术[1]。近期研究显示将抗原特异的TCR基因转导和修饰正常T细胞后,可以诱导出大量表达具有目的TCR基因的T细胞,从而应用于特异性免疫治疗等[2,3]。该研究的基本条件是构建特异性TCRVαTCRVβ双基因表达载体,并证明其可以在真核细胞中表达。我们首先利用Jurkat细胞株独特型TCR基因构建TCRVα1pIRESTCRVβ8表达载体,并将重组质粒转染至A5

5、49和Molt4细胞中,检测其在真核细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况,建立了相应的技术,为进一步研究抗原特异TCR基因表达载体的构建和应用提供了实验方法。　　1材料和方法　　1.1材料Jurkat细胞株、pIRES质粒由本室保存;TRIzol和逆转录酶SurperScriptII试剂盒购自Gibco公司;内切酶NheI、EcoRI、XbaI、SalI购自MBI公司;PurelinkTMQuickPlasmidMiniprepKit和LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司;E.Z.N.ATM.Kit胶纯化回收试剂盒购自OMEGA公司;T4DNA连

6、接酶购自TaKaRa公司;胰酶购自Sigma公司;TCRVβ8单克隆抗体（mAb）购自Serotec公司;RealMastrMix和感受态大肠杆菌DH5α购自北京天为时代公司;倒置相差荧光显微镜为Olympus产品;流式细胞仪为BD公司产品;普通PCR扩增仪为BioMetra产品;荧光定量PCR仪为BIORAD产品;测序和构建引物合成均在上海英骏生物技术有限公司进行。　　1.2方法　　1.2.1RTPCR基因扫描应用TRIzol试剂盒按常规方法提取Jurkat细胞株总RNA,应用随机引物法和逆转录酶SurperScriptII合成cDNA,PCR扩增管家基因β2M检测c

7、DNA合成质量。利用TCRVα亚家族（29个）及TCRVβ亚家族（24个）序列特异性引物对Jurkat细胞株TCR的CDR3区进行RTPCR基因扫描（Genescan）,结果显示其TCRVα1亚家族及TCRVβ8亚家族呈单克隆性[1,4]。　　1.2.2引物设计和PCR对Jurkat细胞株TCRVα1亚家族及TCRVβ8亚家族基因序列进行测序分析,根据测序结果与GenBank的序列比对,分别设计TCRVα1亚家族及TCRVβ8亚家族的扩增引物,序列如下:(1)TCRVα1亚家族:上游引物(2条)F15′ATTG