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时间:2018-05-02
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1、TLR4和CD14在体外培养的晶状体上皮细胞有表达【关键词】Toll样受体4;CD14;表达;晶状体上皮细胞 Abstract AIM:Tostudytheexpressionsoftolllikereceptor4(TLR4)andCD14inlensepithelialcell(LEC).METHODS:TheexpressionsofTLR4mRNAandCD14mRNAerasechainreaction(PCR)plifiedclearbandsof451bpand348bpedtobeTLR4mRNAandCD14mRNAbymeansofgenesequenceanaly
2、sis.CONCLUSION:ThereareexpressionsofTLR4andCD14inLEC. KEYBI公司产品。一步法RTPCR试剂盒系日本TaKaRa公司产品。琼脂糖系西班牙Condas进口分装试剂。溴化乙锭、Tris碱、溴酚兰、蔗糖、甲醛、RNASampleLoadingBuffer(编号L003001)均购自上海博亚公司。100bpDNAMarker,EDTANa2购自北京天为时代科技有限公司。胰蛋白酶、硼酸和焦碳酸二乙酯(DEPC)系美国Amresco公司产品。DMEM培养基干粉系美国Gibco公司产品。乙二胺四乙酸(EDTA)系美国Augus公司产品。引物
3、由Invitrogen上海英骏生物技术公司合成。蛋白核酸测定仪(德国EppendorfAG22331Humburg)、PCR扩增仪(德国Eppendorf5331型)、电泳仪、凝胶成像分析系统(美国BioRad)。取健康新鲜小牛眼的晶状体前囊膜,用胰蛋白酶消化后加入DMEM培养液,放入37℃,5%CO2培养箱中培养。用倒置显微镜观察原代LEC生长情况。经7~10d细胞基本融合后进行细胞传代。取第3代细胞用于以下实验。 1.2 方法 收集LEC细胞,用Trizol试剂提取总RNA并鉴定,分别取TLR4和CD14样品总RNA0.5mg,总反应体积为25μL,用TaKaRa公司一步法RT
4、PCR试剂盒反转录为cDNA。以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照进行PCR扩增。上下游引物由Invitrogen上海英骏生物技术公司合成。GAPDH上游引物,5ATCGTCGCCATCAATGACCC3,下游引物,5ATACTCAGCACCAGCATCACC3,扩增产物为220bp。TLR4上游引物,5ACCACCTCTCCACCTTGATAC3,下游引物,5CCAGCCAGACCTTGAATACAG3,扩增产物为451bp。CD14上游引物,5CCGAAGCCTGACTGGTCTAG3,下游引物,5ACCTCCTGTTGTCCACGAT
5、AC3,扩增产物为348bp。TLR4和CD14的反应条件:50℃预变性30min,94℃2min;PCR扩增94℃45s,53℃(57℃为CD14的退火温度)30s,72℃1min,共28次循环;最后72℃延伸3min。PCR产物以15g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像分析系统做条带灰度扫描并拍照,将扩增结果与GeneBank的基因序列比较。2 结果 采用Trizol一步法提取LEC总RNA,A260/A280均介于1.8~2.0之间,表明RNA纯度高。凝胶电泳结果(图1),可见28S和18S条带边缘清晰,无拖尾,28S比18S约为2∶1,表明RNA样品结构完整、无降解,可进行RTP
6、CR扩增。以LEC总RNA为模板,用一步法RTPCR技术,分别扩增TLR4和CD14,经15g/L琼脂糖凝胶电泳(图2,3)显示分别获得451bp和348bp的清晰扩增条带,与预计扩增片断的大小相符。PCR扩增完毕后,将TLR4和CD14分别于15g/L的琼脂糖凝胶进行电泳,回收、纯化后,ABIPRISM377自动测序仪进行RTPCR产物核苷酸序列测定,结果与GeneBank中的基因序列一致,证明为TLR4和CD14。 3 讨论 TLR4在眼内多种组织中也有分布。2001年Song等[7]研究发现HCEC能表达TLR4mRNA,且当LPS与HCEC共同孵育后能引起TLR4mRNA表
7、达上调。他同时还发现人角膜基质细胞和角膜内皮细胞也能表达TLR4mRNA和CD14mRNA[8]。2004年Ueta等[9]报道HCEC能表达TLR2mRNA和TLR4mRNA及其相应蛋白。2004年Brito等[10]报道人睫状体不含色素的上皮细胞能高表达内毒素受体蛋白TLR4和CD14。2004年Kumar等[8]报道人视网膜色素上皮细胞能表达TLR1至TLR7,TLR9,TLR10的mRNA,其中TLR1mRNA和
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