tlr4和cd14在体外培养的晶状体上皮细胞有表达

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1、TLR4和CD14在体外培养的晶状体上皮细胞有表达【关键词】Toll样受体4；CD14；表达；晶状体上皮细胞　　Abstract　AIM：Tostudytheexpressionsoftolllikereceptor4（TLR4）andCD14inlensepithelialcell(LEC).METHODS：TheexpressionsofTLR4mRNAandCD14mRNAerasechainreaction(PCR)plifiedclearbandsof451bpand348bpedtobeTLR4mRNAandCD14mRNAbymeansofgenesequenceanaly

2、sis.CONCLUSION:ThereareexpressionsofTLR4andCD14inLEC.　　KEYBI公司产品。一步法RTPCR试剂盒系日本TaKaRa公司产品。琼脂糖系西班牙Condas进口分装试剂。溴化乙锭、Tris碱、溴酚兰、蔗糖、甲醛、RNASampleLoadingBuffer（编号L003001）均购自上海博亚公司。100bpDNAMarker，EDTANa2购自北京天为时代科技有限公司。胰蛋白酶、硼酸和焦碳酸二乙酯（DEPC）系美国Amresco公司产品。DMEM培养基干粉系美国Gibco公司产品。乙二胺四乙酸（EDTA）系美国Augus公司产品。引物

3、由Invitrogen上海英骏生物技术公司合成。蛋白核酸测定仪（德国EppendorfAG22331Humburg）、PCR扩增仪（德国Eppendorf5331型）、电泳仪、凝胶成像分析系统（美国BioRad）。取健康新鲜小牛眼的晶状体前囊膜，用胰蛋白酶消化后加入DMEM培养液，放入37℃，5%CO2培养箱中培养。用倒置显微镜观察原代LEC生长情况。经7～10d细胞基本融合后进行细胞传代。取第3代细胞用于以下实验。　　1.2　方法　　收集LEC细胞，用Trizol试剂提取总RNA并鉴定，分别取TLR4和CD14样品总RNA0.5mg，总反应体积为25μL，用TaKaRa公司一步法RT

4、PCR试剂盒反转录为cDNA。以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照进行PCR扩增。上下游引物由Invitrogen上海英骏生物技术公司合成。GAPDH上游引物，5ATCGTCGCCATCAATGACCC3，下游引物，5ATACTCAGCACCAGCATCACC3，扩增产物为220bp。TLR4上游引物，5ACCACCTCTCCACCTTGATAC3，下游引物，5CCAGCCAGACCTTGAATACAG3，扩增产物为451bp。CD14上游引物，5CCGAAGCCTGACTGGTCTAG3，下游引物，5ACCTCCTGTTGTCCACGAT

5、AC3，扩增产物为348bp。TLR4和CD14的反应条件：50℃预变性30min,94℃2min；PCR扩增94℃45s，53℃（57℃为CD14的退火温度）30s，72℃1min，共28次循环；最后72℃延伸3min。PCR产物以15g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统做条带灰度扫描并拍照，将扩增结果与GeneBank的基因序列比较。2　结果　　采用Trizol一步法提取LEC总RNA，A260/A280均介于1.8～2.0之间，表明RNA纯度高。凝胶电泳结果（图1），可见28S和18S条带边缘清晰，无拖尾，28S比18S约为2∶1，表明RNA样品结构完整、无降解，可进行RTP

6、CR扩增。以LEC总RNA为模板，用一步法RTPCR技术，分别扩增TLR4和CD14，经15g/L琼脂糖凝胶电泳（图2，3）显示分别获得451bp和348bp的清晰扩增条带，与预计扩增片断的大小相符。PCR扩增完毕后，将TLR4和CD14分别于15g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，回收、纯化后，ABIPRISM377自动测序仪进行RTPCR产物核苷酸序列测定，结果与GeneBank中的基因序列一致，证明为TLR4和CD14。　　3　讨论　　TLR4在眼内多种组织中也有分布。2001年Song等[7]研究发现HCEC能表达TLR4mRNA，且当LPS与HCEC共同孵育后能引起TLR4mRNA表

7、达上调。他同时还发现人角膜基质细胞和角膜内皮细胞也能表达TLR4mRNA和CD14mRNA[8]。2004年Ueta等[9]报道HCEC能表达TLR2mRNA和TLR4mRNA及其相应蛋白。2004年Brito等[10]报道人睫状体不含色素的上皮细胞能高表达内毒素受体蛋白TLR4和CD14。2004年Kumar等[8]报道人视网膜色素上皮细胞能表达TLR1至TLR7，TLR9，TLR10的mRNA，其中TLR1mRNA和