mip4的突变体构建及其对嗜酸粒细胞趋化的抑制

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1、MIP4的突变体构建及其对嗜酸粒细胞趋化的抑制：李树钧，戚好文，叶江枫，帝新宇，季少平，何鹏，张英起，药立波【关键词】嗜酸粒细胞　　【Abstract】AIM:ToinvestigatetheactivityofMIP4mutant(MetMIP4)inblockingeosinophilschemotaxisinvitrobyexpressingMetMIP4inE.coliandpurifyingit.METHODS:ThegeneofMetMIP4inedbySDSPAGEgelelectrophoresis.Proteininsupernatantotaxisinedo

2、taxisplatefilter.RESULTS:ThepRSETMetMIP4fusionproteinasthmaticbloodandEosinophilpurityotaxis.CONCLUSION:ThepRSETMetMIP4proteinhasbeencorrectlyexpressedinE.coliandthefusionproteinissoluble.Studyofthebiologicalfunctionofthefusionproteinindicatesthatthefusionproteincaninhibiteosinophilschemotax

3、isinvitro.　　【Keyotacticfactors;eosinophils;geneexpression;geicvectors　　【摘要】目的：为研究MIP4（巨噬细胞炎性蛋白4）的突变体在拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用中的活性，构建MIP4突变体（MetMIP4）并进行原核表达和纯化，体外观察其拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用.方法：将MetMIP4基因片段插入到pRSETA融合表达载体中.诱导表达后，表达工程菌经超声裂菌后鉴定可溶性，细菌裂解上清经镍螯合亲和层析纯化.采用葡聚糖沉淀法分离和纯化嗜酸粒细胞，利用24孔Transokinereceptor3,CCR3)在这个过程中

4、起到主要作用.CCR3特异地表达于嗜酸粒细胞、Th2细胞表面［１，２］，已经在几种动物模型中证明可以通过同源重组减少Eotaxin.用这种配体的抗体或注射受体拮抗剂MetRANTES减少过敏性炎症［３，４］.文献［５］证实MetMIP4是一种强力和特异的CCR3拮抗剂，在1nmol・L-1浓度时就能完全阻滞最强力的CCR3激动剂Eotaxin和MCP4引起的嗜酸粒细胞趋化.我们通过合成经过改造的CCR3拮抗剂pRSETMetMIP4，进行表达和纯化，并观察对嗜酸粒细胞趋化功能的影响.　　1材料和方法　　1．1材料克隆载体pUC19、表达载体pRSETA和Ecoli

5、JM109(DE3)由本校生物化学与分子生物学教研室提供；DNA重组所用各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录酶、PCR反应系统（TaqDNA聚合酶、dNTP，10×PCR缓冲液及MgCl2）购自华美生物工程公司；葡聚糖购自Sigma公司；TransHI双酶切，回收切下的目的片段与切开的pRSETA载体，用T4DNA连接酶连接后，转化入大肠杆菌JM109(DE3)中，挑取克隆，用上海华舜试剂盒提取质粒，经EcoRI和BamIH双酶切鉴定获得阳性克隆.　　1．2．2pRSETMetMIP4融合蛋白的表达重组的pRSETMetMIP4阳性克隆重新转化大肠杆菌JM109(DE3)

6、中，于含氨苄青霉素（100mg・L-1）的培养基中，37℃培养过夜，转接后培养至A600nm=0.5左右，加入IPTG（异丙基D硫代半乳糖苷）至终浓度为0.2mmol・L-1,24℃诱导（为增加可溶性）培养2h.常规方法收菌，进行SDSPAGE凝胶电泳观察融合蛋白的表达［６］.　　1．2．3pRSETMetMIP4融合表达蛋白的可溶性分析获得融合蛋白表达的菌株经大量诱导后收菌，加入细菌裂解液（50mmol・L－１NaH2PO4,pH8.0,300mmol・L-1NaCl,1mmolPMSF），超声裂菌（输出功率为40Hz,

7、4℃,2×1min）.12000g，4℃离心30min，收集上清和沉淀，分别加入2×上样缓冲液（100mmol・L-1TrisCl,200mmol・L-1DTT,40g・L-1SDS,2g・L-1溴酚蓝,200mL・L-1甘油）,煮沸5min，离心5min，进行SDSPAGE凝胶电泳，观察融合蛋白的可溶性.　　12.4融合表达蛋白pRSETMetMIP4的纯化获得表达的融合蛋白的菌株经大量诱导后收菌，PBS洗2遍，加入MC