mip4的突变体构建及其对嗜酸粒细胞趋化的抑制论文

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1、MIP4的突变体构建及其对嗜酸粒细胞趋化的抑制论文李树钧，戚好文，叶江枫，帝新宇，季少平，何鹏，张英起，药立波【关键词】嗜酸粒细胞【Abstract】AIM:ToinvestigatetheactivityofMIP4mutant(MetMIP4)inblockingeosinophilschemotaxisinvitrobyexpressingMetMIP4inE.coliandpurifyingit.METHODS:ThegeneofMetMIP4inedbySDSPAGEgelelectrophoresis.Proteininsupernatantotaxisinedot

2、axisplatefilter.RESULTS:ThepRSETMetMIP4fusionproteinasthmaticbloodandEosinophilpurityotaxis.CONCLUSION:ThepRSETMetMIP4proteinhasbeencorrectlyexpressedinE.coliandthefusionproteinissoluble.Studyofthebiologicalfunctionofthefusionproteinindicatesthatthefusionproteincaninhibiteosinophilschemotaxi

3、sinvitro.【Keyotacticfactors;eosinophils;geneexpression;geicvectors【摘要】目的：为研究MIP4（巨噬细胞炎性蛋白4）的突变体在拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用中的活性.freelokinereceptor3,CCR3)在这个过程中起到主要作用.CCR3特异地表达于嗜酸粒细胞、Th2细胞表面［１，２］，已经在几种动物模型中证明可以通过同源重组减少Eotaxin.用这种配体的抗体或注射受体拮抗剂MetRANTES减少过敏性炎症［３，４］.文献［５］证实MetMIP4是一种强力和特异的CCR3拮抗剂，在1nmolL-1浓度时就

4、能完全阻滞最强力的CCR3激动剂Eotaxin和MCP4引起的嗜酸粒细胞趋化.我们通过合成经过改造的CCR3拮抗剂pRSETMetMIP4，进行表达和纯化，并观察对嗜酸粒细胞趋化功能的影响.1材料和方法1．1材料克隆载体pUC19、表达载体pRSETA和EcoliJM109(DE3)由本校生物化学与分子生物学教研室提供；DNA重组所用各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录酶、PCR反应系统（TaqDNA聚合酶、dNTP，10×PCR缓冲液及MgCl2）购自华美生物工程公司；葡聚糖购自Sigma公司；TransHI双酶切，回收切下的目的片段与切开的pRSETA载体，用T4DN

5、A连接酶连接后，转化入大肠杆菌JM109(DE3)中，挑取克隆，用上海华舜试剂盒提取质粒，经EcoRI和BamIH双酶切鉴定获得阳性克隆.1．2．2pRSETMetMIP4融合蛋白的表达重组的pRSETMetMIP4阳性克隆重新转化大肠杆菌JM109(DE3)中，于含氨苄青霉素（100mgL-1）的培养基中，37℃培养过夜，转接后培养至A600nm=0.5左右，加入IPTG（异丙基D硫代半乳糖苷）至终浓度为0.2mmolL-1,24℃诱导（为增加可溶性）培养2h.常规方法收菌，进行SDSPAGE凝胶电泳观察融合蛋白的表达［６］.1．2．3pRSETMetMIP4融合表达蛋白的可

6、溶性分析获得融合蛋白表达的菌株经大量诱导后收菌，加入细菌裂解液（50mmolL－１NaH2PO4,pH8.0,300mmolL-1NaCl,1mmolPMSF），超声裂菌（输出功率为40Hz,4℃,2×1min）.12000g，4℃离心30min，收集上清和沉淀，分别加入2×上样缓冲液（100mmolL-1TrisCl,200mmolL-1DTT,40gL-1SDS,2gL-1溴酚蓝,.freelLL-1甘油）,煮沸5min，离心5min，进行SDSPAGE凝胶电泳，观察融合蛋白的可溶性.12.4融合表达蛋白pRSETMetMIP4的纯化获得表达的融合蛋白的菌株经大量诱导后收菌

7、，PBS洗2遍，加入MCAC0（20mmolL-1TrisCl，05molL-1NaCl,100mLL-1甘油，1mmolPMSF，pH7.9），超声裂菌（输出功率为40Hz,4℃,2×1min）.12000g，4℃离心30min，收集上清，加入TritonX100至终浓度为1mLL-1,经0.45μm滤膜过滤.滤过后的上清以10~15mLh-1的流速过Ni2+-NTA柱.随后分别以MCAC0，MCAC30（MCAC0中加入咪唑至30mmolL-1），MCAC100（MCAC0中加入咪唑至1