ebv lmp2a逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

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1、EBVLMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立【摘要】目的构建含EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录?聚合酶链反应(RT?PCR)扩增获取目的基因LMP2A,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro?2A,脂质体法将pMSCVpuro?2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT?PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒

2、表达载体;筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆;收获病毒的滴度为3.2×107CFU/L,且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro?2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67?LMP2A。【关键词】疱疹病毒4型人逆转录病毒潜伏膜蛋白2APT67细胞系[ABSTRACT]ObjectiveToestablisharetroviralvectorencodingEpstein?Barrvirus(EBV)latentmembraneprotein2A(LMP2A)an

3、dastablevirusproducingcellline.MethodsThetargetgeneLMP2AamplifiedbyRT?PCRidpMSCVpuro?2Aine2000.Thetransfectantsycinandviraltitertested.TheexpressionofLMP2AinPT67celllineerasechainreaction(PCR),restrictiveanalysis,andDNAsequencing.AstablevirusproducingcelllineentplifiedfromPT67?LMP2Acells,thisre

4、sultindicatedthatLMP2AcouldeffectivelyexpressinpackagingcellPT67.ConclusionTherebinantretroviralvectorpMSCVpuro?2Aan;retrovirus;latentmembraneprotein2A;PT67celllineEB病毒(EBV)属人类γ亚科疱疹病毒,是传染性单核细胞增多症(IM)的病原体,与鼻咽癌(NPC)、Burkitts淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多种肿瘤的发生有关。潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)是EBV潜伏期膜蛋白的一种,在体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中

5、均能检测出LMP2A,并且是NPC、BL等肿瘤细胞能稳定表达的少数EBV保守抗原之一,提示LMP2A参与EBV在淋巴细胞中的长期潜伏,并且可能在恶性肿瘤的发生发展中起一定作用。由于LMP2A分子具有潜在的T细胞激活表位,能介导杀伤性T细胞发挥作用,因此越来越多的研究表明,LMP2A是治疗EBV相关肿瘤理想的靶抗原。但LMP2A的生物学功能尚不清楚,为深入研究LMP2A的生物学活性,本研究通过逆转录病毒载体介导LMP2A基因的转移,旨在建立能稳定产生携带LMP2A基因的逆转录病毒的产毒细胞系PT67?LMP2A。1材料和方法1.1主要材料和试剂BglⅡ、EcoRⅠ及T4DNA连接酶购自

6、TaKaRa公司;脂质体转染试剂lipofectamine2000和嘌呤霉素(puromycin)购自美国Invitrogene公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品;胎牛血清购自杭州四季青公司;携带嘌呤霉素抗性基因(puro)的pMSCVpuro质粒系中国海洋大学于文功教授惠赠;工程菌Ecoli.JM109为本实验室保存菌种。1.2细胞逆转录病毒包装细胞PT67购自中国武汉典型培养物保藏中心,用含体积分数0.10的胎牛血清、100kU/L的青霉素、100g/L链霉素的DMEM,于37℃体积分数0.05的CO2培养箱中培养。1.3逆转录病毒的制备1.3.1引物设计和目的基

7、因的制备根据GenBank提供的LMP2A基因编码序列,DNAstar软件设计扩增EBVLMP2A读码框架的特异性引物,并在上游引物和下游引物的5′端分别引入BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点和保护碱基。其上游引物序列为:5′?GGCAGATCTATGGGGTCCCTAGAAATGG?TG?3′,下游引物序列为:5′?CGGAATTCTTATACAGTGTTGCGATATGG?3′,扩增产物的长度为1500bp。用TRIzol法提取EBV阳性LCL细胞总RNA,

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1、EBVLMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立【摘要】目的构建含EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录?聚合酶链反应(RT?PCR)扩增获取目的基因LMP2A,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro?2A,脂质体法将pMSCVpuro?2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT?PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒

2、表达载体;筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆;收获病毒的滴度为3.2×107CFU/L,且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro?2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67?LMP2A。【关键词】疱疹病毒4型人逆转录病毒潜伏膜蛋白2APT67细胞系[ABSTRACT]ObjectiveToestablisharetroviralvectorencodingEpstein?Barrvirus(EBV)latentmembraneprotein2A(LMP2A)an

3、dastablevirusproducingcellline.MethodsThetargetgeneLMP2AamplifiedbyRT?PCRidpMSCVpuro?2Aine2000.Thetransfectantsycinandviraltitertested.TheexpressionofLMP2AinPT67celllineerasechainreaction(PCR),restrictiveanalysis,andDNAsequencing.AstablevirusproducingcelllineentplifiedfromPT67?LMP2Acells,thisre

4、sultindicatedthatLMP2AcouldeffectivelyexpressinpackagingcellPT67.ConclusionTherebinantretroviralvectorpMSCVpuro?2Aan;retrovirus;latentmembraneprotein2A;PT67celllineEB病毒(EBV)属人类γ亚科疱疹病毒,是传染性单核细胞增多症(IM)的病原体,与鼻咽癌(NPC)、Burkitts淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多种肿瘤的发生有关。潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)是EBV潜伏期膜蛋白的一种,在体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中

5、均能检测出LMP2A,并且是NPC、BL等肿瘤细胞能稳定表达的少数EBV保守抗原之一,提示LMP2A参与EBV在淋巴细胞中的长期潜伏,并且可能在恶性肿瘤的发生发展中起一定作用。由于LMP2A分子具有潜在的T细胞激活表位,能介导杀伤性T细胞发挥作用,因此越来越多的研究表明,LMP2A是治疗EBV相关肿瘤理想的靶抗原。但LMP2A的生物学功能尚不清楚,为深入研究LMP2A的生物学活性,本研究通过逆转录病毒载体介导LMP2A基因的转移,旨在建立能稳定产生携带LMP2A基因的逆转录病毒的产毒细胞系PT67?LMP2A。1材料和方法1.1主要材料和试剂BglⅡ、EcoRⅠ及T4DNA连接酶购自

6、TaKaRa公司;脂质体转染试剂lipofectamine2000和嘌呤霉素(puromycin)购自美国Invitrogene公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品;胎牛血清购自杭州四季青公司;携带嘌呤霉素抗性基因(puro)的pMSCVpuro质粒系中国海洋大学于文功教授惠赠;工程菌Ecoli.JM109为本实验室保存菌种。1.2细胞逆转录病毒包装细胞PT67购自中国武汉典型培养物保藏中心,用含体积分数0.10的胎牛血清、100kU/L的青霉素、100g/L链霉素的DMEM,于37℃体积分数0.05的CO2培养箱中培养。1.3逆转录病毒的制备1.3.1引物设计和目的基

7、因的制备根据GenBank提供的LMP2A基因编码序列,DNAstar软件设计扩增EBVLMP2A读码框架的特异性引物,并在上游引物和下游引物的5′端分别引入BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点和保护碱基。其上游引物序列为:5′?GGCAGATCTATGGGGTCCCTAGAAATGG?TG?3′,下游引物序列为:5′?CGGAATTCTTATACAGTGTTGCGATATGG?3′,扩增产物的长度为1500bp。用TRIzol法提取EBV阳性LCL细胞总RNA,

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