ebvlmp2a逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立　

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1、EBVLMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立【摘要】目的构建含EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)的逆转录病毒表达载体，筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录?聚合酶链反应(RT?PCR)扩增获取目的基因LMP2A,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro?2A，脂质体法将pMSCVpuro?2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RT7PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及

2、测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体；筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆收获病毒的滴度为X107CFU/L，且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro?2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒，进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67?LMP2A。【关键词】疱疹病毒4型人逆转录病毒潜伏膜蛋白2APT67细胞系[ABSTRACT]ObjectiveToestablisharetroviralvectorencodingEpstein?Barrvirus(

3、EBV)latentmembraneprotein2A(LMP2A)andastablevirusproducingcelltargetgeneLMP2AamplifiedbyRT?PCRwassubclonedintoretroviralvectorpMSCVpuro.TherecombinantplasmidpMSCVpuro?2AwastransfectedintopackagingcellPT67bylipofectamine2000.Thetransfeetantswereselectedbypuromycinandviraltite

4、rtested.TheexpressionofLMP2AinPT67celllinewasidentifiedbyRT?PCR.ResultsTherecombinantretroviralvectorpMSCVpuro?2Awasidentifiedbypolymerasechainreaction(PCR),restrictiveanalysis,andDNAsequencing.AstablevirusproducingcelllinewasselectedandtheviraltiterwasX107CFU/L.Theexpectedl

5、5OObpfragmentwasamplifiedfromPT67?LMP2Ace11s，thisresultindicatedthatLMP2AcouldeffectivelyexpressinpackagingcellPT67.ConclusionTherecombinantretroviralvectorpMSCVpuro?2Awasconstructedsuccessfully.AstableviralprodueingcelllinePT67?LMP2Awasselectedandestablished.Thisstudyestabl

6、ishedafoundationforfurtherstudyofLMP2A.[KEYWORDS]herpesvirus4,human:retrovirus:latentmembraneprotein2A;PT67celllineEB病毒(EBV)属人类Y亚科疱疹病毒，是传染性单核细胞增多症(頂)的病原体，与鼻咽癌(NPC)、Burkitts淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多种肿瘤的发生有关。潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)是EBV潜伏期膜蛋白的一种，在体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中均能检测出LMP2A，并且是NPC、BL等肿瘤细胞能稳定表达

7、的少数EBV保守抗原之一，提示LMP2A参与EBV在淋巴细胞中的长期潜伏，并且可能在恶性肿瘤的发生发展中起一定作用。由于LMP2A分子具有潜在的T细胞激活表位，能介导杀伤性T细胞发挥作用，因此越来越多的研宄表明，LMP2A是治疗EBV相关肿瘤理想的靶抗原。但LMP2A的生物学功能尚不清楚，为深入研宄LMP2A的生物学活性，本研究通过逆转录病毒载体介导LMP2A基因的转移，旨在建立能稳定产生携带LMP2A基因的逆转录病毒的产毒细胞系PT67?LMP2A。1材料和方法主要材料和试剂Bgill、EcoRI及T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；脂质体

8、转染试剂lipofectamine2000和卩票呤霉素(puromycin)购自美国Invitrogene公司；四甲基偶氮卩坐盐(MTT)为Sigma