丙酸氟替卡松对哮喘小鼠气道重塑及tgfβ1表达的影响

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1、丙酸氟替卡松对哮喘小鼠气道重塑及TGFβ1表达的影响　　1材料和方法　　1.1材料　　Balb/c小鼠30只，雄性，体质量(20±2)g，第四军医大学实验动物中心提供.鸡卵白蛋白(ovalbumin，OVA)，丙酸氟替卡松干粉（美国Sigma公司）；TGFβ1兔抗小鼠多克隆抗体（北京中山生物工程有限公司）；链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物(streptavidinbiotionplex,SABC)免疫组化检测试剂盒（北京中山生物技术有限公司）.　　1.2方法　　1.2.1动物分组和模型的建立　　雄性小鼠30只，随机分为哮喘组(A组)，正常对照组

2、(B组)，丙酸氟替卡松治疗组(C组)，每组动物10只.参照文献［5］的方法，A组：第l日腹腔注射OVA氢氧化铝混悬液0.2mL(内含OVA10μg及氢氧化铝20μg)，第l5日重复致敏1次，自第22日开始予以25g/LOVA生理盐水溶液雾化吸入，每日1次，每次30min，持续4in吸入丙酸氟替卡松，浓度为0.17g/L（10mgFP加入60mL生理盐水），每次吸入时间10min，持续4，部分切片经苏木精伊红(HE)染色并行病理学观察，部分进行免疫组化染色.　　1.2.3免疫组化SABC法　　石蜡切片脱蜡至水，30g/L过氧化氢室温孵育10min，以消

3、除内源性过氧化物酶的活性，微波加热行抗原修复处理，滴加一抗兔抗鼠多克隆抗体(1∶100)，二抗生物素化山羊抗兔IgG(1∶200)，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，阴性对照以磷酸盐缓冲液代替一抗而其它条件均相同.　　1.2.4定量及计算机图像分析　　参照文献［6］的方法，将待测切片放在连接计算机的显微镜下放大400倍，找到完整的肺内支气管横断面，每只动物切片随机选取直径100～200μm完整的小支气管横截面5个，采用leikaQ500分析系统测定支气管基底膜周径(basementmembraneperimeter,Pbm)，总管壁面积(airoo

4、thmusclearea,)，并用Pbm将测量值标准化，分别以，/Pbm表示，代表相应管壁层的厚度.免疫组化染色后以图像分析系统测定各气道的灰度值(蛋白含量高则灰度值低)，每只动物取5个小气道，平均后作为该标本的灰度值.统计学处理：采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，实验数据均以x±s表示，采用单因素方差分析，组间差别采用LSDt检验.　　2结果　　2.1肺组织病理学改变光镜下观察结果显示，A组气道壁及气道平滑肌明显增厚，黏膜下层增宽，黏膜皱褶增多，管腔狭窄，有时可见黏液栓堵塞，气道上皮细胞脱落，杯状细胞增多，黏膜下及管周有大量炎性细胞浸润.C

5、组上述改变较A组明显减轻(图1).　　2.2气道形态学测定图像分析　　图像分析结果显示:A组（17.43±1.10）μm2/μm，B组(11.52±1.76)μm2/μm,C组(14.06±1.20)μm2/μm,A组与B组比较,C组与A组比较组间差异具有统计学意义（P<0.01）.ＷAm/Ｐbm:A组（6.58±1.16）μm2/μm，B组(3.42±0.75)μm2/μm,C组(4.41±1.00)μm2/μm,A组与B组比较,C组与A组比较组间差异具有统计学意义（P<0.01）.　　3讨论　　目前，吸入糖皮质激素能有效控制气道炎症已得

6、到公认，但它能否有效防治气道重塑尚存在争议.丙酸氟替卡松是一种新型的脂溶性糖皮质激素,抗炎能力是布地奈德和二丙酸倍氯米松的12倍和20倍，Femandes等［7］的研究发现，丙酸氟替卡松可抑制凝血酶刺激的体外培养的人气道平滑肌细胞的增殖反应,但对表皮生长因子刺激的气道平滑肌细胞增殖反应无效.本实验采用体内给药方法,研究发现C组在每日OVA激发前给予丙酸氟替卡松雾化吸入,其平滑肌厚度较A组明显降低(P<0.01)，提示早期应用丙酸氟替卡松可抑制平滑肌厚度的增加，其气道壁总厚度较A组也明显降低(P<0.01)，提示丙酸氟替卡松对改善气道重塑具有

7、积极的作用.　　TGFβ1是目前发现最强的促纤维化因子，也是哮喘气道重塑研究中的重点.Vignola等［8］的研究表明，哮喘患者支气管上皮、粘膜中TGFβ1免疫反应性显著增高.我们在实验中采用免疫组化方法半定量地检测了三组小鼠气道壁中TGFβ1含量，发现三组小鼠的肺组织中均有较广泛的免疫染色阳性表达，A组表达明显增强，主要集中在气道上皮和粘膜下以及气管和血管的平滑肌层，与文献报道一致.本实验发现,从免疫组化染色切片中可见到，粘膜下的TGFβ1阳性细胞占多数，主要由嗜酸细胞和巨噬细胞组成，这提示哮喘时TGFβ1可能主要于嗜酸细胞和巨噬细胞而不是气道上

8、皮细胞.有大量的研究已经表明［9-11］,TGFβ1能刺激气道平滑肌细胞分裂与增殖，导致平滑肌