白藜芦醇对大肠癌细胞htert表达及其启动子的影响

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1、白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT表达及其启动子的影响：王晓燕，范钰，张尤历，钟锡明【摘要】目的：观察白藜芦醇对大肠癌细胞生长增殖的影响，并从人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)表达及其启动子方面探讨可能的抗癌机制。方法：以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS174T细胞后，收集细胞，分别采用荧光实时定量RTPCR和蛋白质印迹法检测癌细胞hTERTmRNA和蛋白水平。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至大肠癌LS174T细

2、胞中后，加入不同浓度的白藜芦醇，孵育48h后，检测报告基因萤虫素酶活性。结果：白藜芦醇处理大肠癌细胞后，增殖明显受到抑制，且与浓度有关。癌细胞hTERTmRNA和蛋白水平明显下调，且呈浓度和时间依赖性。白藜芦醇处理组萤虫素酶活性下降，且呈浓度依赖性。结论：hTERT启动子活性和hTERT表达下调，可能是白藜芦醇抑制癌细胞增殖的重要机制之一。【关键词】白藜芦醇;大肠肿瘤;人端粒酶逆转录酶;启动子　　[Abstract]Objective:Toinvestigatetheeffectofresveratrolon

3、humantelomerasereversetranscriptase(hTERT)anditspromoterofhumancolorectalcancercell.Methods：AfterLS174ThumancolorectalcancercellRNAandproteinofhTERTinedbyrealtimePCRand标记探针：5′FAMAGCTCCCATTTCATCAGCAAGTTTGGAATMARA3′。　　1.2白藜芦醇对大肠癌细胞增殖的影响　　参照文献[9]进行，方法简略如

4、下：以不同浓度(12.5，25，50，100，200，400μmol/L)的白藜芦醇处理大肠癌细胞不同时间(24，48，72h)后，每孔加入5mg/ml的MTT20μl，继续培养4h，去上清。每孔加入二甲基亚砜0.1ml，摇床向上摇动约15min，用酶标仪在波长570nm处计数各孔光密度值(D值)。每组设3复孔。　　细胞生长抑制率(inhibitionratio，IR)=　　1-转染组试验孔D值空白对照孔D值×100%　　1.3白藜芦醇对大肠癌细胞hTERTmRNA水平的影响　　1.3.1RNA提取、逆转录c

5、DNA合成根据说明书提取细胞总RNA和合成cDNA。　　1.3.2荧光实时定量PCR根据文献[10]进行。50μl反应体系：hTERT基因上、下游引物各1.5μl，FAM1μl，GAPDH探针2.5μl，2×PCRMix缓冲液26μl，cDNA10μl，H2O7.5μl。然后再进行检测，循环反应条件为：50℃，2min，1个循环;95℃，10min，1个循环;95℃,15s，60℃，1min。40个循环。　　1.3.3荧光实时定量PCR结果分析测试样本一式3份，进行多次重复。hTERT基因表达的mRNA，以内

6、参照GAPDH基因的表达按照如下公式进行相对定量：cDNAhTERT=cDNAGAPDH×2ΔCT(ΔCT=CTGAPDH-CThTERT)[cDNAhTERT和cDNAGAPDH分别表示hTERT和GAPDH的cDNA量，CTGAPDH及CThTERT表示cDNA经PCR扩增到一定量时的循环数]。　　1.4白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT蛋白水平的影响　　采用蛋白质印迹法检测。收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗2次，加入细胞裂解液，在冰面上静置10～20min,用细胞刮匀浆后，4℃，离心10min，转速1500

7、0r/min，取上清,加入1/3体积的4×上样缓冲液，煮沸10min使蛋白变性。样品蛋白经凝胶电泳分离、电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭1h后加入hTERT单克隆抗体(1∶500)，4℃孵育过夜。漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶500)，37℃孵育1h，漂洗后用ECL显色，曝光，冲洗胶片。　　1.5大肠癌细胞hTERT启动子活性测定　　1.5.1质粒转染大肠癌LS174T细胞以5×105/孔接种于6孔培养板，24h后根据脂质体说明书进行转染。将待转染质粒以脂质体DNA复合物的形式(比例为1∶

8、10)加入上述细胞培养孔中，同时转染内对照SV40质粒。3复孔，重复3次。　　1.5.2萤虫素酶活性测定质粒转染2h后加入不同浓度的白藜芦醇,24h后更换含10%胎牛血清的新鲜培养液及相应浓度的白藜芦醇,于37℃细胞培养箱继续培养24h后，用预冷的PBS洗3遍，消化收集细胞，加入1×PLB裂解液处理细胞后，用荧虫素酶试剂盒及萤虫素酶测定仪测定萤虫素酶活性。　　1.6统计学处理　　所得数据用±s表示，