sirna沉默annexin1基因对膀胱癌t24细胞生物学特性的影响

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1、siRNA沉默Annexin1基因对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响：高琳杨远航1徐万海林相国李建章杨德君王晓民【摘要】目的观察RNA干扰技术沉默Annexin1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖能力的影响。方法针对Annexin1基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(siRNA),脂质体介导瞬时转染膀胱癌T24细胞，转染后应用半定量RTPCR和TT法检测沉默Annexin1表达对膀胱癌T24细胞增殖的影响。结果转染siRNA后膀胱癌T24细胞Annexin1mRNA和蛋白水平显著下降(P<0.05)，转染siRNA沉默Annex

2、in1基因表达后膀胱癌T24细胞出现典型凋亡细胞，增殖能力显著下降(P<0.05)。结论RNA干扰Annexin1基因后其mRNA和蛋白水平显著下降，诱导了膀胱癌T24细胞凋亡，并且抑制细胞的增殖。【关键词】膀胱癌;Annexin1;siRNA　　【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectsofAnnexin1genesilencingbysmallinterferingRNA(siRNA)onbladdercancercellsT24invitro.MethodsThreesiRNAtargetingthreed

3、ifferentdomainsofAnnexin1geneineTM2000.Aftertransfection,expressionofAnnexin1issionelectronicmicroscope(TEM)orphology.ThecellularproliferationinhibitoryratioRNAandprotein.Annexin1genesilencingreducedtheproliferativecapacityofT24cellsandleadedtotumorcellsapoptosisaftertransfection

4、.ConclusionsThechemicallysynthesizedspecificsiRNAtargetingAnnexin1couldeffectivelyreducetheexpressionofAnnexin1gene,reducetheproliferativecapacityofT24cellsandinducetumorcellsapoptosis.　　【Keybion公司。阳离子脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000、Trizol、MMLV购自Invitrogen生命技术公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶购自G

5、IBCO公司。　　1.2小干扰RNA(siRNA)的设计及合成根据GenBank中Annexin1基因序列(GenBankAccessionNo.NM000700)和siRNA设计原则，应用Ambion生物公司的设计软件(siRNATargetFinderandDesignTools)，自Annexin1mRNA的起始密码子开始，寻找“AA”二连序列，记下其3′端的19个碱基序列作为候选的siRNA靶序列。将候选序列在GenBank中用Blast软件进行同源序列搜索，排除那些和其他基因编码序列或EST同源的候选序列。最终选择了3段21个碱基的siRNA序列

6、(TI、TⅡ、TⅢ)，分别靶向Annexin1基因的240260(SI)，435455(SⅡ)和506526(SⅢ)区域(见表1)。另外，根据转染后细胞形态学变化，设计与TI(240siRNA)序列含有同样核苷酸比例的随机对照siRNA(240c1，240c2)做为阴性对照，用Blast验证随机序列与GenBank中其他已知人类基因序列没有同源性。利用针对三磷酸甘油醛脱氢酶(βactin)基因的正、反义寡核苷酸模板作为RNA干扰实验的阳性对照。设计的正反义寡核苷酸模板3′端均加上T7启动子引物5′CCTGTCTC3′，由上海生工生物工程技术服务有限公

7、司合成。　　1.3引物的设计与合成设计1对Annexin1的引物，上游：5′GACCACCTCAACTCAAGGAC3′,下游：5′AGGAAGCTGGATGAAGAGAC3′，长度546bp，同时设计1对管家基因βactin引物，上游：5′ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG3′，下游：5′AGAGGTCCTTACGGATGTCAACG3′，长度290bp，由上海生工合成。　　1.4细胞培养常规RPMI1640培养，至转染前夜，细胞培养液更换为用无血清和无抗生素的IMDM，置于37℃、5%CO2孵箱,转染后用20%FBSIMDM培

8、养液,按常规方法培养,取处于对数生长期