针刺及艾灸对m3受体mrna表达的调节作用

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1、针刺及艾灸对M3受体mRNA表达的调节作用　　我们通过药物乌头碱诱发家兔心律失常，利用RT-PCR法检测不同组别的家兔心脏M3受体mRNA的表达变化，探讨针刺及艾灸对M3受体mRNA表达的调节作用，为针刺和艾灸治疗心律失常提供实验依据。　　1、材料与方法　　1.1实验动物新西兰家兔，雄性，3～4月龄，体质量2～3kg，清洁级，上海生旺实验动物养殖有限公司提供，合格证号：SCXK（沪）2007-0007。　　1.2主要试剂乌头碱（中国药品生物制品检验所，批号：110720-200410）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司，批号：20060323）；总R

2、NA提取试剂盒、RT试剂盒（美国Invitrogen试剂公司）；引物由上海生工生物工程有限公司合成；PCR试剂盒（中国Tiangen公司）。　　1.3主要仪器PTC-200PCR仪（美国ABI公司）；RM6240B多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂）；AllegraTM64R低温高速离心机（美国Beckman公司）；DYY-III2水平电泳仪（北京六一仪器厂）；DU530紫外分光光度计（美国Beckman公司）；ZF-90紫外透射仪（上海顾村电光仪器厂）；GENEGENIUS生物成像系统（美国Syngene公司）；BCM-1000超净工作台（苏州净

3、化设备有限公司）。　　1.4方法　　1.4.1动物分组新西兰家兔40只，随机分为对照组、药物组、针刺内关穴组、艾炙组4组，每组10只。每组家兔腹腔注射乌来糖1.1g／kg麻醉后，用标准肢体Ⅱ导联连接，连续记录心电。药物组：耳缘静脉注射乌头碱25μg／kg；对照组：耳缘静脉注射等容量的生理盐水；针刺内关穴组：耳缘静脉注射乌头碱25μg／kg后，电针内关穴，电针20min，频率3Hz，变频10Hz，强度以家兔能够耐受，保持安静，不引起挣扎为度；艾灸组：耳缘静脉注射乌头碱25μg／kg后，在内关穴用特制固定器点燃艾条，在所取范围往返温和熏

4、灸，艾条与穴位距离以家兔能耐受为度，艾灸时间20min。　　1.4.2心肌组织M3受体mRNA表达的检测4组家兔24h后处死，迅速取下左心室，剪成1cm1cm。用总RNA提取试剂盒提取总RNA，利用琼脂糖甲醛变性凝胶电泳分析其质量，并用紫外分光光度计测定其纯度和含量。取3μg总RNA进行逆转录反应，取3μL逆转录反应产物进行PCR反应。引物：M3上游引物：5-GGTGT-GATGATTGGTCTGGC-3，下游引物：5-TTC-CAACTGTCACTGCTGCT-3，扩增片段为458bp。　　同时设置β－actin为内参，上游引

5、物：5-CTCAT-GAAGATCCTCACCGA-3，下游引物：5-ATCTC-CTTCTGCATCCTGTC-3，扩增片段为387bp。PCR反应条件为：预变性94℃3min，94℃45s，58℃45s，72℃1min，循环30次后，72℃末端延伸10min。PCR产物上样于1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳，UV照相和密度扫描。　　1.5统计学处理数据用x±s表示，用SPSS15.0统计学软件进行处理，不同组间的数据用单因素方差分析和LSD检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。　　2、结果　　2.1模型制备模型组耳缘静脉注射乌头碱25

6、μg／kg，观察心电图的变化，记录心律失常的发生情况。　　2.2电针干预对家兔心肌M3受体mRNA表达的影响表1。结果显示，与正常对照组比较，药物组M3受体的mRNA表达明显增加，针刺内关穴后，M3受体的mRNA表达与药物组比较有明显降低，P＜0.05。　　2.3艾灸干预对家兔心肌M3受体mRNA表达的影响表2。结果显示，与正常对照组比较，药物组M3受体的mRNA表达明显增加，P＜0.05。艾灸组与药物组比较，M3受体的mRNA表达有明显降低P＜0.05，但较针刺内关穴组，M3受体的mRNA表达有所升高，差异不显著。　　3、讨论　　3.1心律失

7、常的病因复杂，可由多种因素引起心肌电生理的异常。乌头碱能直接兴奋心肌，激活Na+通道，促进Na+内流，对L型Ca2+通道也有明显的通透作用，加速细胞膜的去极化，提高心房传导组织和房室束-浦肯野系统等快反应细胞的自律性，这是乌头碱致心律失常的主要机制。心脏在交感神经和副交感神经的精细控制下完成正常的生理功能，心脏迷走神经通过刺激M型乙酰胆碱受体，调节心脏收缩力、兴奋性和传导。近些年发现，M3受体不仅具有负性肌力和负性频率的作用，还可以介导一种新的钾电流，并且在充血性心力衰竭、缺血性心律失常等疾病的发生发展中发挥着重要作用。目前，越来越多的证据表明，心脏

8、M3受体是一种新型的抗心律失常药物靶点。研究表明M3受体在病理状态下和生理状态下的功能性表达是不同的。Shi