纯化内耳组织抗原免疫致豚鼠自身免疫性梅尼埃病的实验研究

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1、纯化内耳组织抗原免疫致豚鼠自身免疫性梅尼埃病的实验研究：李玉瑾，谭长强，黄和，蔡文君，李霜【摘要】目的：探讨4种纯化的内耳抗原免疫致梅尼埃病样内耳病变的情况，从而了解各抗原的致病性，并明确其在内耳的分布情况。方法：70只豚鼠随机分成A、B、C、D、E5组（A组10只，余4组各15只），以豚鼠内耳组织抗原的4种亚组分（相对分子质量依次为28000、42000、58000和68000）作为抗原，依次免疫B、C、D和E组豚鼠，观察听觉功能、前庭功能、血清特异性抗体水平和内耳形态学的改变，并应用免疫组化方法确定其在耳蜗的分布和表达。结果：免疫前后A（对照）、B组平均听阈无显著性差异，亦未见明

2、显的内耳病理形态学改变。免疫后B、C、D、E组血清特异性抗体水平显著升高。免疫后B组未发现听损动物，C组3只动物（4耳）、D组4只动物（6耳）、E组4只动物（6耳）出现听损，部分听损耳出现膜迷路积水和螺旋神经节细胞减少。免疫组化显示68000蛋白抗体主要分布于血管纹，Corti器也有少量分布；28000蛋白抗体主要分布于螺旋神经节；42000和58000蛋白则在螺旋神经节、血管纹和螺旋韧带部位均有分布。结论：粗制内耳抗原中42000、58000和68000亚组分均能独立诱发自身免疫性梅尼埃病样内耳病变，实验性自身免疫性梅尼埃病的致病内耳抗原组分可能并非一种。【关键词】梅尼埃病；自身免

3、疫疾病；纯化抗原；豚鼠梅尼埃病（Menieresdisease,MD）是临床上较为常见的一种内耳疾病，膜迷路积水是其主要内耳病理改变，但其病因至今仍未完全明确。近年来，大量实验研究和临床观察的结果显示，部分MD患者的发病机制可能与内耳的自身免疫性病理损伤有关，有将其称为自身免疫性MD（autoimmuneMenieresdisease,AIMD)，即属于一种自身免疫性内耳病。本项目组在前期实验研究中发现，同种粗制内耳抗原（crudeinnerearantigen,CIEAg）免疫豚鼠可诱发类似MD病变，并进一步采用D模型动物与非模型动物比对分析方法，发现相对分子质量为68000、

4、58000、42000、28000的4种蛋白组分可能是其主要的致病内耳抗原成分［1］。本研究拟分离纯化这4种主要内耳抗原，进而用其免疫豚鼠，观察和了解各自致病性，从而明确主要致病的内耳组织抗原成分。1材料和方法1.1动物南京市青龙山实验动物繁殖场提供的白毛、红眼、体健豚鼠375只，体重250～300g，耳廓反射正常，耳镜检查排除中耳疾患。其中300只用于制取内耳抗原，70只用于实验观察研究，5只用于颞骨切片行免疫组化观察。1.2内耳抗原的分离纯化豚鼠CIEAg的制取基本参照先前报道的方法[2]:将豚鼠清醒断头，取听泡，在体视显微镜下分离膜迷路组织[包括基底膜、螺旋韧带、膜半规管、椭圆

5、囊和球囊（祛除耳石器）］，放入0.1mol·L-1pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）中，经研磨、冻溶、超声粉碎、匀浆、离心（1000r·min-1，5min）后取上清液，采用紫外分光光度计测定蛋白含量。按于栋桢等［3］报道的方法，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析技术，参照对应大小预染Marker将目的分子质量大小条带切胶，分离纯化出CIEAg中相对分子质量分别为28000、42000、58000和68000的4种蛋白组分（以下简称28000、42000、58000和68000蛋白）。1.3免疫动物将70只豚鼠随机分成A、B、C、D、E5组，其中A组为对照组，10只；余B、C、D、E组为实验组

6、，各15只，分别采用28000、42000、58000和68000蛋白抗原免疫。首次给予相当于400μgCIEAg电泳所得各组分对应条带的凝胶匀浆液0.2ml与等量完全弗氏佐剂（Sigma公司，美国）乳化后注射于豚鼠右后足垫和背部多点皮下，以后每隔2周，采用首次抗原用量的一半与等量不完全弗氏佐剂注射作为强化免疫，共2次。再间隔2周，进行内淋巴囊（endolymphaticsac,ES）局部免疫,具体方法：3%戊巴比妥钠30mg·kg-1腹腔注射麻醉，双侧枕骨后凹进路，切削钻头磨开双侧枕骨、颅骨后凹骨质，暴露ES，B、C、D、E组豚鼠双侧ES部位分别注入相当于50μgCIEAg电泳所得

7、的28000、42000、58000、68000对应条带的凝胶匀浆液0.05ml，A组以不含抗原的凝胶匀浆液代替含抗原的凝胶匀浆液在与上述相同的时间和部位采用相同的方法注射。骨蜡填充骨质缺损，充分止血后缝合皮肤。1.4观察指标1.4.1血清特异性抗体测定分别于免疫前和ES局部免疫后2周采集动物血清，采用酶联免疫吸附分析（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）法检测针对各种纯化内耳抗原的抗体水平。主要步骤为：分别采用10