rna干扰nucleostemin基因对人食管癌eca109细胞株增殖影响的实验研究

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1、RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影响的实验研究【关键词】Nucleostemin（NS）;RNA干扰；食管癌；基因表达；细胞增殖　　Abstract：ObjectiveToscreenNSgenespecificpositivecellclones,andinvestigatetheeffectofhumanesophaguscancerEca109cellsproliferationinvitrobyNSgenespecificRNAinterference.MethodsTheNSsiRNAex

2、pressionvectoranesophaguscancerEca109cellsusingLIPOFECTAMIM2000Reagent,andpositiveclonesinedbyPCRafterstabletransfectansscreeninganesophaguscancerEca109cellsproliferationinvitroandreducethelevelofNSgeneexpression.　　Keyin（NS）;RNAinterference;Esophaguscancer；Geneexpression;

3、Cellproliferation　　0引言　　NS基因是美国国立卫生研究院的学者MckayandTsai2002年新发现的一种蛋白质核因子［1］，该基因在干细胞及人类的数种肿瘤细胞中表达丰度很高，但在分化的成体组织中，该基因却不表达。二位学者提出干细胞与癌细胞均由相同的蛋白质－NS来决定其细胞自我复制的能力，NS可能是干细胞和肿瘤细胞通过G2/S检验点的特异性调控因子。本文将以人食管癌Eca109细胞株为实验材料探讨NS基因特异性RNA干扰对食管癌Eca109细胞株体外增殖能力的影响。　　1材料和方法　　1.1材料人食管癌Eca109

4、细胞购于上海细胞所；1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶为Gibco公司；PCDNA4/CNSsilencer质粒[2]；MTT、DMSO、Zeocin、LipofectamineTM2000Reagent：Invitrogen公司;RNA、DNA试剂盒;RTPCR试剂盒：TaKaRa公司;引物合成：上海申能博彩生物科技有限公司。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养及NS基因转染　　人食管癌Eca109细胞培养于含10%FBS的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2潮湿空气的CO2培养箱内培养。脂质体法将PCDNA4/CNS

5、silencer质粒及空载体PCDNA4/Cvector质粒转染Eca109细胞，分别命名为silencer组、vector组，未转染的Eca109细胞记为normal组。转染细胞进行Zeocin抗生素筛选；阳性细胞克隆继续在含Zeocin抗生素的培养基中进行扩大培养。　　1.2.2阳性细胞克隆的鉴定　　提取克隆细胞基因组DNA，以Zeocin基因为目的基因，通过PCR方法进行细胞克隆外源基因整合阳性鉴定，同时以normal组肿瘤细胞作对照。其引物序列为：上游引物5′atggccaagttgaccagtgc；下游引物为5′tcag

6、tcctgctcctcggcca。PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循环，最后72℃延伸10min；PCR产物大小约370bp。　　1.2.3生长曲线的绘制[3]　　将三组细胞传到24孔板上（1×104细胞/孔），每组18复孔，分别于24h、48h、72h、96h、120h、144h用计数板进行活细胞计数，绘出各组细胞的生长曲线。　　1.2.4细胞的形态学观察　　倒置显微镜下观察各组细胞形态变化情况。　　1.2.5MTT比色法测定细胞增殖抑制率[3]　　在96孔

7、培养板上接种三组细胞，每组24复孔（1×103细胞/孔），分别于24h、48h、72h三个时间段进行MTT测定，以培养液做空白对照并调零，用酶标仪测定490nm处的吸光度值（OD值），每次每组测定8复孔。细胞增殖抑制率＝1-细胞存活率即细胞增殖抑制率＝（1-silencer组OD值/Normal组OD值）×100%　　1.2.6各组肿瘤细胞NS基因表达水平检测　　提取肿瘤细胞总RNA，用RTPCR方法验证各组肿瘤细胞NS基因表达情况。参照genebank中NS和GAPDH的基因序列及参考文献[4]设计引物如下:NS基因上游P1：5′atg

8、aaaaggcctaagttaaagaaagc，下游P2：5′gctctccaaattctcctttggta；GAPDH上游为P3：5′ggtggacctgac