川芎嗪对谷氨酸损伤海马神经元的保护作用

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1、川芎嗪对谷氨酸损伤海马神经元的保护作用【摘要】目的观察川芎嗪对谷氨酸损伤海马神经元的保护作用。方法原代培养大鼠海马神经元，培养基中加入1mmol/L的盐酸川芎嗪溶液共同孵育12h后，加入1mmol/L谷氨酸损伤海马神经元20min。采用MTT法检测细胞活性;测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力的变化;细胞免疫组化检测各组细胞表达AchE。结果川芎嗪可提高谷氨酸损伤后海马神经元的存活率，抑制因谷氨酸损伤引起的细胞内LDH的释放，可促进谷氨酸损伤细胞中AChE的表达。结论川芎嗪对谷氨酸诱导海马神经元损伤有保护作用。【关键词】川芎嗪;谷氨酸;海马神经元:Obj

2、ectiveToobservetheprotectiveeffectsofligustrazineonglutamateinducedinjuryinculturedhippocampalneurons.MethodsPrimarilyculturedhippocampalneuronsfromfetalratsmol/L)for12hours,thenglutamate(1mmol/L)inutestoinduceinjury.Cellviabilityinedbybiochemicalmethod.Finally,theexpressionofAc

3、hEintheculturedneuronsmuocytochemistry.ResultsLigustrazineimprovedthesurvivalrateofhippocampalneuronsinjuredbyglutamate,inhibitedthereleaseofLDHfromthekytoplasminjuredbyglutamate.TheexpressionofAchEintheinjuredneuronsotedbypretreatmentofligustrazine.ConclusionLigustrazinecansigni

4、ficantlyexertprotectiveeffectsonthehippocampalneuroninjuryinducedbyglutamate.KEYTT)、二甲亚砜(DMSO)、L多聚赖氨酸、阿糖胞苷为美国Sigma公司产品;胰蛋白酶、DMEM培养基为美国Gibco公司产品;胎牛血清为杭州四季青有限公司产品;6孔板/Ⅱ96孔板为丹麦Costar公司产品;乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;其他试剂均为国产分析纯。Olympus倒置相差显微镜(日本)，CO2培养箱(NAPCO公司)，酶联免疫检测仪(美国BIOTek公

5、司)，兔抗大鼠AchE抗体(1∶1000)、羊抗兔IgG(1∶200)、ABC及DAB显色试剂盒(美国VECTOR公司)。1.2海马神经元的原代培养[2]健康孕15d的SD大鼠，麻醉后无菌条件下取胎鼠脑，解剖显微镜下取出的双侧海马，去除脑膜和血管，2.5g/L胰酶37℃消化10min，用完全培养基(90%DMEM+10%FBS)终止消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度接种于多聚赖氨酸包被的24孔/96孔细胞培养板，置于50mL/LCO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。12h后加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的过度增殖，以后每周换液2次，每次换1/2培养液。培养至神

6、经元分化完全后进行实验。1.3海马神经元Glu损伤模型的建立及分组[3]海马神经元按上法培养7d后，去除原来培养基，用Lockes液(154mmol/LNaCl、5.6mmol/LKCl、3.6mmol/LNaHCO3、2.3mmol/LCaCl2、5.6mmol/LGlucose、5mmol/LHEPES，pH7.4)洗涤细胞3次，每次5min。谷氨酸损伤组，以Lockes液配制1mmol/LGlu20～22℃作用于培养细胞20min，撤除Glu，用Lockes液洗涤细胞3次，每次5min，重新加入原培养基继续培养12h。实验组用Lockes液

7、含有1mmol/LLig加入细胞中培养12h后，再加入Glu作用20min。对照组Lockes液无Glu和Lig。1.4免疫细胞化学染色海马神经元按上法培养7d后，除去培养液，用0.01mol/LPBS洗涤一次，加入40g/L多聚甲醛，室温下固定1h，去除固定液，用0.01mol/LPBS室温下洗涤10min，共3次。用含50mL/L羊血清、含1mL/LTritonX100的PBS液在37℃条件下封闭30min，去除封闭液。滴加一抗(rabbitantiAChmonoclonalantibody，1∶1000)，4℃放置过夜，PBS洗。滴加二抗(g

8、oatantirabbitIgG,1∶200)，室温放置2h，PBS洗。实验中