pgip基因真核表示和sa诱导对苹果叶pgip基因表示之影响

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1、PGIP基因真核表示和SA诱导对苹果叶PGIP基因表示之影响第一章文献综述1.1引言病原真菌侵染植物时,植物细胞壁是第一道防线(RamanandRavi2011)。果胶是细胞壁的主要组分(EladandEvensen1995),主要由多聚半乳糖醛酸链构成(LangandDrnenburg2000)。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases,PGs)是病原真菌入侵时最先分泌的一种酶(Gomathietal.2006),能够降解果胶层的主要组分多聚半乳糖醛酸,从而破坏植物细胞壁,造成植物感染,诱发植物发病(deLorenzoandFerra

2、ri2002;Desiderioetal.1997)。几乎所有病原菌侵染植物时都能够分泌PGs(AlbersheimandAnderson1971)。当PGs分解果胶时,造成了寡半乳糖醛酸苷片段的积累,从而激活植物体的防卫系统,以对抗病原物的入侵(deLorenzoetal.2001;deLorenzoandFerrari2002;LangandDrnenburg2000)。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-InhibitingProtein,PGIP)是植物细胞壁中一种富含亮氨酸重复序列(Leucine-reachrep

3、eat,LRR)的结合蛋白,能专一性地抑制真菌分泌的endo-PG酶活性,从而维护植物细胞壁的完整性(TurnerandHoffman1985)。同时引起高浓度的寡聚半乳糖醛酸(Oligogalacturonsas,OGs)在植物体内的积累,延长具有生物活性的OGs的稳定期,激活包括PGIPs在内的一系列防卫相关基因,从而激活植物体内的防御系统,增强植物的抗病性,更好地抵抗病原真菌的入侵(AlbersheimandAnderson1971;deLorenzoandFerrari2002)。PGIP与PG互作在植物防卫反应上作用已引起广大学者的关注。1

4、.2PGIP与PG互作在植物防卫反应上作用1.2.1PG酶的特点PG酶存在于细菌、真菌、线虫和高等植物中。例如真菌灰葡萄孢属(Karsetal.2005;TenHaveetal.1998)、黑曲霉(Parenicováetal.1998)、米曲霉(Kitamotoetal.1998)、黄曲霉(Shiehetal.1997)、灰霉菌(atteietal.2000),推测可能与PGIPs的热稳定性有关。1.2.3PGIP与PG的相互作用PGIP是一种细胞壁结合糖蛋白,许多植物分泌的胞外PGIP蛋白能够特异性地识别并抑制真菌及昆虫PGs(de

5、LorenzoandFerrari2002;D'Ovidioetal.2004)。而PG酶具有多种不同形式,包括一级结构的不同、稳定性的差异、是否有特殊活性、最适pH值、作用方式的异同、底物偏爱性以及释放低聚糖的类型,使得病原真菌能适应多种宿主及环境(jygclporrumL)中的20多种PGIPs(Favaronetal.1994)都具有抑菌功能,在一定程度上限制致病真菌的生长,并引发植物的防卫反应。不同植物的PGIP能不同程度的抑制同一种病原真菌分泌的PGs(deLorenzoetal.2001),相同的PGIP也能不同程度抑制不同种类真

6、菌分泌的PGs(周立等1998)。但是,研究发现植物本身分泌的PG不能与PGIP相互作用,可见PGIP只能抑制外源PGs的活性(Federicietal.2001;Torkietal.2000)。第二章PGIP基因真核表达2.1材料与方法基因片段的克隆载体pMD18-T-p.p1-1,大肠杆菌DH5α均为本实验室保存。毕赤酵母菌株GS115(Pichiapastoris)、真核表达载体pPICZαB均购自美国Invitrogen(SanDiego,CA)公司。2.1.1主要试剂限制性内切酶KpnI、PstI、BsxtI、T4D

7、NA连接酶均购自大连宝生物公司;所用DNAMarkerBioMarkerⅢ购自北京百迈克公司;蛋白质分子质量marker购自天根公司。2.1.2毕赤酵母表达溶液及培养基2.1.2.1毕赤酵母表达溶液配制10YNB:称取13.4gYNB溶于100ml蒸馏水中,过滤灭菌,4℃保存。500B:称取20mg的生物素溶于100ml蒸馏水中,过滤灭菌,4℃保存。10D:称取20g葡萄糖溶于100ml水中,过滤灭菌,4℃保存。10GY:将10ml甘油和90ml水混匀后,高压灭菌。1M磷酸缓冲液:以1M的磷酸氢二钾和1M的磷酸二氢钾为母液,分别配制pH为5.8,6.

8、0,6.4,7.1或7.2,7.6的磷酸缓冲液。第三章SA诱导对苹果叶片中PGIP基因...........

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1、PGIP基因真核表示和SA诱导对苹果叶PGIP基因表示之影响第一章文献综述1.1引言病原真菌侵染植物时,植物细胞壁是第一道防线(RamanandRavi2011)。果胶是细胞壁的主要组分(EladandEvensen1995),主要由多聚半乳糖醛酸链构成(LangandDrnenburg2000)。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases,PGs)是病原真菌入侵时最先分泌的一种酶(Gomathietal.2006),能够降解果胶层的主要组分多聚半乳糖醛酸,从而破坏植物细胞壁,造成植物感染,诱发植物发病(deLorenzoandFerra

2、ri2002;Desiderioetal.1997)。几乎所有病原菌侵染植物时都能够分泌PGs(AlbersheimandAnderson1971)。当PGs分解果胶时,造成了寡半乳糖醛酸苷片段的积累,从而激活植物体的防卫系统,以对抗病原物的入侵(deLorenzoetal.2001;deLorenzoandFerrari2002;LangandDrnenburg2000)。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-InhibitingProtein,PGIP)是植物细胞壁中一种富含亮氨酸重复序列(Leucine-reachrep

3、eat,LRR)的结合蛋白,能专一性地抑制真菌分泌的endo-PG酶活性,从而维护植物细胞壁的完整性(TurnerandHoffman1985)。同时引起高浓度的寡聚半乳糖醛酸(Oligogalacturonsas,OGs)在植物体内的积累,延长具有生物活性的OGs的稳定期,激活包括PGIPs在内的一系列防卫相关基因,从而激活植物体内的防御系统,增强植物的抗病性,更好地抵抗病原真菌的入侵(AlbersheimandAnderson1971;deLorenzoandFerrari2002)。PGIP与PG互作在植物防卫反应上作用已引起广大学者的关注。1

4、.2PGIP与PG互作在植物防卫反应上作用1.2.1PG酶的特点PG酶存在于细菌、真菌、线虫和高等植物中。例如真菌灰葡萄孢属(Karsetal.2005;TenHaveetal.1998)、黑曲霉(Parenicováetal.1998)、米曲霉(Kitamotoetal.1998)、黄曲霉(Shiehetal.1997)、灰霉菌(atteietal.2000),推测可能与PGIPs的热稳定性有关。1.2.3PGIP与PG的相互作用PGIP是一种细胞壁结合糖蛋白,许多植物分泌的胞外PGIP蛋白能够特异性地识别并抑制真菌及昆虫PGs(de

5、LorenzoandFerrari2002;D'Ovidioetal.2004)。而PG酶具有多种不同形式,包括一级结构的不同、稳定性的差异、是否有特殊活性、最适pH值、作用方式的异同、底物偏爱性以及释放低聚糖的类型,使得病原真菌能适应多种宿主及环境(jygclporrumL)中的20多种PGIPs(Favaronetal.1994)都具有抑菌功能,在一定程度上限制致病真菌的生长,并引发植物的防卫反应。不同植物的PGIP能不同程度的抑制同一种病原真菌分泌的PGs(deLorenzoetal.2001),相同的PGIP也能不同程度抑制不同种类真

6、菌分泌的PGs(周立等1998)。但是,研究发现植物本身分泌的PG不能与PGIP相互作用,可见PGIP只能抑制外源PGs的活性(Federicietal.2001;Torkietal.2000)。第二章PGIP基因真核表达2.1材料与方法基因片段的克隆载体pMD18-T-p.p1-1,大肠杆菌DH5α均为本实验室保存。毕赤酵母菌株GS115(Pichiapastoris)、真核表达载体pPICZαB均购自美国Invitrogen(SanDiego,CA)公司。2.1.1主要试剂限制性内切酶KpnI、PstI、BsxtI、T4D

7、NA连接酶均购自大连宝生物公司;所用DNAMarkerBioMarkerⅢ购自北京百迈克公司;蛋白质分子质量marker购自天根公司。2.1.2毕赤酵母表达溶液及培养基2.1.2.1毕赤酵母表达溶液配制10YNB:称取13.4gYNB溶于100ml蒸馏水中,过滤灭菌,4℃保存。500B:称取20mg的生物素溶于100ml蒸馏水中,过滤灭菌,4℃保存。10D:称取20g葡萄糖溶于100ml水中,过滤灭菌,4℃保存。10GY:将10ml甘油和90ml水混匀后,高压灭菌。1M磷酸缓冲液:以1M的磷酸氢二钾和1M的磷酸二氢钾为母液,分别配制pH为5.8,6.

8、0,6.4,7.1或7.2,7.6的磷酸缓冲液。第三章SA诱导对苹果叶片中PGIP基因...........

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