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1、益生菌制剂对雏鸡盲肠菌群的部分作用机制 在畜牧业生产过程中,利用抗生素治疗和预防疾病带来的种种弊端逐渐被人们所认识,2006年欧盟决定禁止使用任何抗生素作为饲料添加剂。益生菌作为一类能通过调控生物体微生态平衡进而有效促进宿主健康生长的活微生物制剂,一直被认为是抗生素的最佳替代者之一。关于对雏鸡肠道菌群的研究已有较多,但是关于益生菌和抗生素对肉雏鸡盲肠菌群发育规律的影响作用还鲜有报道。本研究以屎肠球菌和金霉素为试验材料,通过对不同日龄肉雏鸡盲肠内容物的16SrDNAV3区进行PCR-DGGE指纹图谱比较分析,从不同角度研究益生菌制剂的部分作用机
2、制以及日粮中添加抗生素的可能影响。 1、材料与方法 1.1试验材料与试验动物 试验材料为华中农业大学农业微生物学重点实验室专利菌株(专利号:ZL201110452087.2)屎肠球菌HDRsEf1株,湖北华大瑞尔科技有限公司生产,每克菌粉的活菌数≥30亿。 试验动物为1日龄健康白羽肉鸡科宝500,购自湖北宜昌正大有限公司。 1.2试验设计与样品采集 1)屎肠球菌定植动物试验。选用1日龄健康白羽肉鸡80只随机分成对照组(玉米-豆粕基础日粮)和益生组(添加300g屎肠球菌菌粉/1000kg),每组分别在1、3、5、7、9、11日龄
3、时颈静脉放血处死5只雏鸡,在超净台内快速采集盲肠内容物并混合,置4℃冰箱备用。 2)屎肠球菌和抗生素对雏鸡肠道菌群的影响试验。试验选用1日龄新生白羽肉鸡180只,随机分成对照组(玉米-豆粕基础日粮)、益生组(添加300g屎肠球菌菌粉/1000kg)和抗生素组(添加50mg金霉素/kg)。每组3个重复,每个重复20只鸡。试验周期为42d,每组分别在7、14、21、28、35、42日龄时颈静脉放血处死6只试验鸡,在超净台内快速采集盲肠内容物,将每个组的6只雏鸡内容物混合,置4℃冰箱备用。 1.3细菌总DNA的提取 参照文献,采用QIAampD
4、NAStoolMiniKit,按照操作手册提取细菌总DNA。用核酸浓度测定仪测定总DNA浓度,置-20℃保存备用。 1.4RT-PCR 法检测盲肠中屎肠球菌、大肠杆菌和乳酸杆菌的数量实时荧光定量PCR所用的引物见表1。检测屎肠球菌数量的荧光定量PCR反应条件: 95℃预变性30s;95℃变性5s,60℃延伸30s,40个循环。检测大肠杆菌和乳酸杆菌数量的荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30s;95℃变性5s,55℃退火20s,72℃延伸30s,40个循环。每次荧光定量PCR循环结束后溶解曲线从65℃逐步升到95℃。荧光定量PCR体系的
5、最终体积控制在20μL,反应试剂均按PremixExTaqTM试剂说明书的推荐量添加。 1.5基因组特异性片段 V3区的扩增为了检测各组肠道菌群的变化情况,用引物GC341f(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATTACCGCGGCTGCTGG-3′)和519r(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)扩增16SrRNA的V3区片段,扩增条件是94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火20s,72℃延伸30s,35个
6、循环;最后72℃延伸10min。 PCR反应体系(25μL):2PCRmix12.5μL,上下游引物(10pmol/L)各1μL,DNA模板2μL,ddH2O补足至25μL。 1.6基因组特异性片段 V3区的变性梯度凝胶电泳(DGGE)使用Bio-RadDcode进行DGGE凝胶电泳。 变性剂梯度范围为38%~55%,100%的变性剂包含7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺。电泳在恒温60℃条件下1TAE缓冲液中进行,先200V预电泳10min,然后65V电压电泳16h。参照文献[7]方法用硝酸银染色,对完
7、成显色后的凝胶拍照,再用相应软件对图谱进行分析。 1.7数据分析 采用UPGMA进行聚类分析,以香农多样性指数H′表示菌群多样性的高低,SPSS18.0进行PCA分析和显著性差异分析。 2、结果与分析 2.1益生性屎肠球菌 HDRsEf1株在雏鸡肠道菌群定植的确定如图1所示,随着雏鸡日龄的增加,益生菌组中雏鸡盲肠中的屎肠球菌的数量逐渐增加,到第5日龄时基本达到稳定,而对照组的屎肠球菌的数量在5日龄以后逐渐降低,说明该株屎肠球菌HDRsEf1可以在雏鸡盲肠内定植,并且在5日龄时就基本达到稳定。 2.2大肠杆菌和乳酸杆菌
8、数量的检测 由表2可见,饲料中添加屎肠球菌HDRsEF1和抗生素可以显著减少21日龄时雏鸡盲肠中大肠杆菌的数量(P<0.05),而在42日龄时
