jnk在cgvhd狼疮样小鼠肾组织表达及在肾纤维化中作用研究

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1、JNK在cGVHD狼疮样小鼠肾组织表达及在肾纤维化中作用研究【摘要】目的：观察cJun氨基末端激酶(JNK)在慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样小鼠肾组织中的表达情况，初步探讨其在狼疮肾炎肾脏纤维化中所起的作用。方法：建立cGVHD狼疮样小鼠模型。将小鼠分为12周正常对照组、16周正常对照组、12周模型组及16周模型组4组，每组6只，于12周末处死12周正常对照组和12周模型组小鼠，16周末处死16周正常对照组和16周模型组小鼠，采用双缩脲比色法观察各组小鼠24h尿蛋白排泄量，HE和Masson染色观察肾间质纤维化程度，免

2、疫组织化学法定位检测JNK、pJNK在肾组织的表达，RTPCR法检测各组JNKmRNA表达及asson染色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理学变化。1.5免疫组织化学检测SABC法行免疫组织化学染色(试剂盒购于晶美生物技术有限公司)：取2μm厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min；滴加胃蛋白酶修复抗原，37℃孵育15min；加含10%羊血清的封闭液在室温下封闭30min；滴加兔抗小鼠JNK、pJNK(Thr183/Tyr185)多克隆抗体(1∶400，CellSignaling公司)，4℃孵育过夜，

3、37℃复温30min；滴加生物素偶联的羊抗兔IgG抗体；37℃孵育30min；加HRP标记的链亲和素，37℃孵育30min；DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。以PBS替代一抗后作为阴性对照，阳性时呈棕黄色。1.6gCl2(25mmol·L-1)、1μlOligodT、2μldNTPs(10mmol·L-1)、0.25μlRNaseinhibitor、1μlAMV逆转录酶(TaKaRa公司)、2.75μl总RNA，30℃10min后42℃逆转录50min，99℃灭活逆转录酶5min，5℃5min，所得cDNA-20℃保存用于P

4、CR扩增。1.7.3PCR扩增JNK及GAPDH内参照引物用DNAClub软件设计，由上海Invitrogen公司合成，序列见表1。表1目的基因上下游引物及其扩增片段长度PCR反应体系为:5×PCR缓冲液10μl、MgCl2(25mmol·L-1)4μl、dNTPs(10mmol·L-1)1μl、上下游引物(10μmol·L-1)各1μl、cDNA模板1μl、TaqDNA聚合酶(5U·μl-1)(TaKaRa公司)0.25μl，补足双蒸水至50μl。EppendorfAG22331PCR扩增仪扩增。96℃预变性3min；96℃变

5、性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min，循环38次；72℃终末延伸10min。1.7.4产物检测扩增产物在含0.5mmol·L-1溴乙锭的1%琼脂糖凝胶中以4～5V·cm-1电压降电泳30min。于ImageMasterVDS凝胶扫描仪上成像,用TotallabV2.01凝胶图像分析软件进行半定量分析。所有JNK产物的吸光度均以GAPDH为基准较正,以JNK/GAPDH表示。1.8统计学处理计数资料以x-±s表示，各组之间比较采用多因素方差分析或秩和检验，相同时间点两组之间采用t检验或秩和检验，采用SPSS13.0统计软

6、件进行处理，P<0.05为差异具有统计学意义。2结果2.124h尿蛋白定量结果12周与16周模型组小鼠24h尿蛋白总量均显著高于相应正常对照组小鼠(P<0.01)，16周模型组小鼠24h尿蛋白总量与12周模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。表2各组小鼠24h尿蛋白检查结果1）与正常对照组比较，P<0.01；2）与12周模型组比较，P<0.052.3免疫组织化学染色结果2.3.1肾组织中JNK表达变化12周及16周正常对照组小鼠肾小球脏层上皮、近端及远端肾小管均有少量JNK表达；12

7、周模型组小鼠肾小球系膜细胞、内皮细胞、脏层上皮细胞及肾小管间质中阳性细胞数目增加，阳性表达颜色加深；16周模型组小鼠肾组织中JNK表达更加明显。见图1。A.12周正常对照组；B.12周模型组；C.16周正常对照组；D.16周模型组图1各组小鼠肾组织JNK蛋白免疫组织化学染色结果DAB显色×4002.3.2肾组织中pJNK表达变化12周及16周正常对照组小鼠仅肾小管间质有极少量的pJNK表达；12周模型组小鼠肾组织pJNK主要表达在肾小球系膜细胞、内皮细胞、脏层上皮细胞及近端和远端肾小管，16周模型组小鼠肾组织pJNK表达

8、更加显著。见图2。2.4.DNAladdermarker；A.16周模型组JNK；B.12周模型组表4各组小鼠肾组织JNKmRNA表达的半定量分析1）与正常对照组比较，P<0.01；2）与12周模型组比较，P<0.01MAPK）超家族成员之一，属于进