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《p38mapk在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达研究【摘要】目的：探讨慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样小鼠肾组织p38MAPK的表达变化,进而分析p38MAPK在狼疮肾炎肾纤维化发生中的作用。方法：将12只雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1杂交鼠随机分为模型组及正常对照组,每组6只。于16周末处死，取肾行HE和Masson染色，应用免疫组化方法检测TGF-β1、p38MAPK、P-p38MAPK在肾脏的定位表达，RT-PCR法研究各组肾组织TGF-β1、p38MAPKmRNA的表达,APK、P-p38MAPK蛋白的表达水平，并观察两组小鼠24h尿
2、蛋白排泄量。结果：与正常对照组比较,模型组小鼠24h尿蛋白排泄量、TGF-β1、p38MAPK和P-p38MAPK蛋白及mRNA表达均明显增加(P＜0.01),TGF-β1与p38MAPK的表达呈正相关(r=0.418,P＜0.05)。结论：cGVHD狼疮样小鼠肾组织中TGF-β1、p38MAPK和P-p38MAPK蛋白及mRNA表达明显上调,p38MAPK信号通路可能在狼疮肾炎肾纤维化的进程中起重要作用。【关键词】慢性移植物抗宿主病；狼疮肾炎；p38MAPK；小鼠狼疮肾炎（lupusnephritis,LN）是系统性红斑狼疮（systemiclupuserythe
3、matosusSLE）最重要的临床表现之一，其病理改变以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征，最终急性或慢性进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭。肾脏纤维化不仅是各型LN进展到终末期的共同病理表现，而且也是患者病情的重要反映指标，在其发展过程中，多种因素发挥着重要作用,其中TGF-β1起着关键作用。有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotEinkinase,MAPK)级联是细胞内重要的信号转导系统,它参与胞外信号从表面转导到细胞内部的过程,为细胞内信息传递的共同通路。近年来许多研究结果表明，其亚族p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)作为信
4、号转导通路的交汇点在肾脏纤维化的发生发展中起着重要作用，但在LN肾纤维化的发生过程中是否起作用尚未见报道。因此本研究通过构建慢性移植物抗宿主病(chronicgraftversushostdisease,cGVHD)狼疮样小鼠模型,探讨作为TGF-β1下游信号介质，p38MAPK在LN发展过程中的表达与活化及其可能的作用机制。1材料与方法1.1实验动物8～10周龄雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1杂交鼠(以下称杂交鼠)及6～7周龄DBA/2小鼠购自中山大学医学动物中心,体重(20.17±1.20)g,SPF级，饲养于本校公共卫生学院SPF动物房。1.2模型的建
5、立与分组［1］制作cGVHD狼疮样小鼠模型。按随机、对照设计原则将12只杂交鼠分成模型组及正常对照组,每组6只。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞,制成单细胞悬液(约60%脾细胞、30%胸腺及10%淋巴结细胞),分别于0、3、7、10d经尾静脉注射于模型组杂交鼠,用台盼蓝染色和细胞计数板计数,保证活细胞数大于95%,且每次给予细胞数为50×106个。正常对照组则于相应时间经尾静脉注射等体积生理盐水。两组小鼠首次尾静脉注射后每两周留取1次24h尿,至16周处死动物，立即取下肾脏,一部分置于-70℃低温保存,另一部分置于10%中性福尔马林溶液中固定后行组织病理学检查
6、。1.324h尿蛋白量测定用双缩脲比色法测定尿蛋白,小鼠尿液1∶5稀释后按操作说明书操作。1.4RT-PCR1.4.1总RNA提取从-70℃低温冰箱中取出肾组织,迅速用Trizol(晶美生物技术有限公司)匀浆提取总RNA。取5μl总RNA进行甲醛变性凝胶电泳,紫外灯下观察5、18、28s条带清晰提示RNA完整无降解。1.4.2逆转录逆转录反应体系如下:在PCR管中加入10×逆转录缓冲液1μl,MgCl2(25mmol·L-1)2μl,OligodT1μl,dNTPs(10mmol·L-1)2μl,RNaseinhibitor0.25μl,AMV逆转录酶(TaKaRa
7、公司)1μl,总RNA2.75μl,30℃10min后42℃逆转录50min,99℃灭活逆转录酶5min,5℃5min,所得cDNA保存于-20℃用于PCR扩增。1.4.3PCR扩增TGF-β1、p38MAPK及GAPDH内参照引物用DNAClub软件设计,由上海英骏生物工程公司合成,序列如下:p38MAPK上游引物5′-tcgagaccgtttcagtccat-3′,下游引物5′-ccacggaccaaatatccact-3′,产物为463bp；TGF-β1上游引物5′-tgcttcagctccacagagaa-3′,下游引物5′-cttgcgacccacgt
