jnk在cgvhd狼疮样小鼠肾组织表达及在肾纤维化中作用研究

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1、JNK在cGVHD狼疮样小鼠肾组织表达及在肾纤维化中作用研究【摘要】目的：观察cJun氨基末端激酶(JNK)在慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样小鼠肾组织中的表达情况，初步探讨其在狼疮肾炎肾脏纤维化中所起的作用。方法：建立cGVHD狼疮样小鼠模型。将小鼠分为12周正常对照组、16周正常对照组、12周模型组及16周模型组4组，每组6只，于12周末处死12周正常对照组和12周模型组小鼠，16周末处死16周正常对照组和16周模型组小鼠，采用双缩脲比色法观察各组小鼠24h尿蛋白排泄量，HE和Masson染色观察肾间质纤维化程度

2、，免疫组织化学法定位检测JNK、pJNK在肾组织的表达，RTPCR法检测各组JNKmRNA表达及Westernblotting技术半定量检测JNK、pJNK蛋白表达水平。结果：12周模型组小鼠24h尿蛋白排泄量，JNK、pJNK蛋白及mRNA的表达与正常对照组相比均明显增加（P<0.01），16周模型组更甚（P<0.01）。结论：JNK、pJNK蛋白及mRNA表达在cGVHD狼疮样小鼠肾组织中明显上调，其可能在狼疮肾炎肾纤维化进程中起着重要作用。【关键词】慢性移植物抗宿主病；狼疮肾炎；cJun氨基末端

3、激酶；肾纤维化；小鼠狼疮肾炎（lupusnephritis，LN）是系统性红斑狼疮（systemiclupus15erythematosus，SLE）患者最常见和最严重的并发症之一，也是SLE患者的主要死亡原因之一，其病变以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征，最终进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭。肾脏纤维化是各型狼疮肾炎进展到终末期的共同病理表现，其主要的发生机制与肾小管上皮细胞转分化、细胞外基质沉积以及细胞内多种促纤维化信号途径被激活等有关。近几年来许多研究结果表明,cJun氨基末端激酶（cJunNterminal

4、kinase，JNK）信号传导通路的功能异常在肾脏纤维化的发生、发展中起着重要作用［1］，但在LN研究尚无报道，因此作者通过构建慢性移植物抗宿主病(chronicgraftversushostdisease，cGVHD)狼疮样小鼠模型，探讨JNK在LN发展过程中的表达与活化及其所起的作用。1材料与方法1.1实验动物8～10周龄雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1杂交鼠(以下称F1代小鼠)及6～7周龄DBA/2小鼠购自中山大学医学动物中心，体重(20.17±1.20)g，SPF级，饲养于本校公共卫生学院SPF级动物房。

5、1.2模型的建立与分组15将F1代小鼠分为12周正常对照组、16周正常对照组、12周模型组及16周模型组4组，每组6只。参考文献［2］制作cGVHD狼疮样小鼠模型。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞，制成比例为约60%脾细胞、30%胸腺细胞及10%淋巴结细胞的单细胞悬液（用台盼蓝染色和细胞计数板计数，保证活细胞数大于95%），分别于第0、3、7、10天经尾静脉注射于模型组F1代小鼠,每次给予细胞数约为50×106个。正常对照组则于相同时间经尾静脉注射等体积生理盐水。4组小鼠首次尾静脉注射后每两周留取1次24h尿，建模后第

6、12周末处死12周正常对照组和12周模型组两组小鼠，16周末处死16周正常对照组和16周模型组两组小鼠，并取下肾脏，一部分置于-70℃低温保存以备提取总RNA和蛋白质，另一部分置于10%中性福尔马林溶液中，经石蜡包埋后切片行免疫组织化学实验和组织病理学检查。1.324h尿蛋白量测定用双缩脲比色法测定24h尿蛋白，小鼠尿液1∶5稀释后按操作说明书操作。1.4组织病理学检查2μm连续切片，置多聚赖氨酸包被的载玻片上，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，分别作HE和Masson染色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理学变化。151.5免疫组

7、织化学检测SABC法行免疫组织化学染色(试剂盒购于晶美生物技术有限公司)：取2μm厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min；滴加胃蛋白酶修复抗原，37℃孵育15min；加含10%羊血清的封闭液在室温下封闭30min；滴加兔抗小鼠JNK、pJNK(Thr183/Tyr185)多克隆抗体(1∶400，CellSignaling公司)，4℃孵育过夜，37℃复温30min；滴加生物素偶联的羊抗兔IgG抗体；37℃孵育30min；加HRP标记的链亲和素，37℃孵育30min；DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。

8、以PBS替代一抗后作为阴性对照，阳性时呈棕黄色。1.6Westernblotting取-70℃保存的肾组织约100mg，加入预冷的蛋白裂解液0.5ml充分裂解。4℃、3000r·min-1离心10min后取上清，测蛋白浓度。取100μg蛋白加入上样缓冲液，煮沸3min后进行12%SDS聚