慢性gvhd狼疮样小鼠肾组织ctgf的异常表达

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1、慢性GVHD狼疮样小鼠肾组织CTGF的异常表达[摘要]目的：观察结缔组织生长因子（CTGF）在慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样小鼠肾组织中的表达情况。方法：参照有关文献建立cGVHD狼疮样小鼠模型。按随机设计原则将模型小鼠分成模型组及正常对照组,每组6只。CTGF蛋白检测采用免疫组织化学及免疫荧光组织化学法，CTGFmRNA表达采用RTPCR法检测；留取24h尿，测定尿蛋白排泄率。结果：模型组小鼠24h尿蛋白总量明显高于正常对照组小鼠(P0.01)；RTPCR检测到模型组小鼠肾组织CTGFmRNA表达较正常对照组小鼠明显升高(P0.01)；免疫组织化学及免疫荧光组织化

2、学表明，正常对照组小鼠仅在少数肾小管有微弱CTGF表达，而模型组小鼠肾小管及间质均可见CTGF蛋白显著表达。结论：cGVHD狼疮样小鼠肾组织中CTGF蛋白及mRNA表达明显上调，可能在狼疮肾炎肾小球硬化及肾间质纤维化的进程中起重要作用。[关键词]慢性移植物抗宿主病；狼疮肾炎；结缔组织生长因子；小鼠　系统性红斑狼疮（systemiclupusnephritis，SLE）是继发性肾小球肾炎最常见的病因之一，是一种自身免疫介导性炎症，以肾小球、肾血管和间质的损害为特征，后期可发展为肾小球硬化、纤维性新月体、肾小管萎缩和间质纤维化等。既往研究证实，转化生长因子β（transform

3、inggroRNA，另一部分置于10％中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋后切片行组织病理学检查。1.324h尿蛋白量测定用双缩脲比色法测定尿蛋白,小鼠尿液1∶5稀释后按操作说明书操作。1.4RTPCR1.4.1总RNA提取从-70℃低温冰箱中取出肾组织，迅速用Trizol（晶美生物技术有限公司）匀浆提取总RNA。取5μl总RNA进行甲醛变性凝胶电泳，紫外灯下观察5、18、28s条带清晰提示RNA完整无降解。1.4.2逆转录逆转录反应体系如下：在PCR管中加入10×逆转录缓冲液1μl，MgCl2（25mmol・L－1）2μl，OligodT1μl,dNTPs（10mmol・L－

4、1）2μl，RN酶抑制剂0.25μl，AMV逆转录酶（Takara公司）1μl，总RNA2.75μl，30℃10min后，42℃逆转录50min，99℃灭活逆转录酶5min，5℃5min，所得cDNA保存于-20℃用于PCR扩增。1.4.3PCR扩增CTGF及GAPDH内参照引物用DNAClub软件设计，由上海生工生物工程公司合成，序列如下：CTGF上游引物5＇atgctcgcctccgtcgcag3＇，下游引物5＇tcaaagatgtcattgtccccag3＇，产物为1007bp；GAPDH上游引物5＇gtgggccgctctaggcaccaa，下游引物3＇ctcttt

5、gtatcacgcacgatttc，产物为452bp。PCR反应体系：5×PCR缓冲液10μl,MgCl2（25mmol・L－1）4μl，dNTPs（10mmol・L－1）1μl,上下游引物（10μmol・L－1）各1μl，cDNA模板1μl，TaqDNA聚合酶（5U・μl－1）（Takara公司）0.25μl，补足双蒸水至50μl。EppendorfAG22331PCR扩增仪扩增,条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s,56℃退火40s,72℃延伸1min,共循环34次；72℃终末延伸10min。1.4.4产物检测扩增产物在含0.5mmol・L-1溴乙锭的1%琼脂

6、糖凝胶中以4～5V・cm－1电压降电泳45min。于ImageMasterVDS凝胶扫描仪上成像，用TotallabV2.01凝胶图像分析软件进行半定量分析。所有CTGF扩增产物的吸光度均以GAPDH为基准较正，以CTGF/GAPDH表示。1.5病理检查2μm连续切片，置多聚赖氨酸包被的载玻片上。二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，HE染色。1.6免疫组织化学检测1.6.1SABC法免疫组织化学染色（试剂盒购于晶美生物技术有限公司）取2μm厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min；滴加胃蛋白酶修复抗原，37℃孵育15min；加含10%羊血清的封闭液在室温下封闭30

7、min；滴加兔抗小鼠CTGF多克隆抗体(1∶50,Upstate公司），4℃孵育过夜，37℃复温30min；滴加生物素偶联的羊抗兔IgG抗体，37℃孵育30min；加HRP标记的链亲和素，37℃孵育30min；DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。阴性对照：以PBS替代一抗。1.6.2免疫荧光组织化学(间接法)取2μm厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min；滴加胃蛋白酶修复抗原，37℃孵育15min；加含10%羊血清的封闭液在室温下封闭30min；滴加兔抗小鼠CTGF多克隆抗体(1∶50,Up